狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗免疫效果评价

狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病是当前危害养犬业的三种重要传染病。为探讨狂犬病毒(RABV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)灭活制备三联灭活疫苗的可行性,将该3种病毒HEP-Flury株、LN(10)1株和JL(18)1-Beagle株分别在BHK-21、Vero/DogSLAM(VDS)和F81细胞培养,经β-丙内酯灭活剂灭活后,分别与三种不同类型免疫佐剂(MONTANIDE GEL 02、ADJ-801(W)、Al(OH)3)配制成三联灭活疫苗。疫苗经三次免疫比格犬后,通过测定动物血清抗体水平和攻毒保护情况评价其免疫效果。实验结果显示,不同佐剂的三联灭活疫苗对增强比格犬RABV、CDV和CPV血清抗体应答反应效果不同。其中ADJ-801(W)佐剂能显著提高针对RABV、CDV和CPV三种病毒的抗体水平,疫苗三次免疫比格犬后血清抗体效价分别为7.4 EU/mL、1∶50和1∶1024;而Al(OH)3佐剂效果较差,三免后抗体效价分别为4.01 EU/mL、1∶6和1∶256。疫苗三次免疫后,分别应用强毒CDV SD(14)7株和CPVJL(18)1-Beagle株对比格犬进行攻毒实验,实验结果显示,ADJ-801(W)组对SD(14)7和JL(18)1-Beagle攻毒保护率均为100%,MONTANIDE GEL 02组攻毒保护率均为60%,而Al(OH)3组攻毒保护率均为0,表明ADJ-801(W)佐剂制备的狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗对比格犬提供较好的免疫保护作用。本研究为犬狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗的研制奠定了基础。

连花清瘟药渣及发酵产物的生物活性研究

旨在研究连花清瘟药渣和发酵产物的生物学活性,探明自然发酵、优化发酵1(4MYL)和优化发酵2(Y4ML)三种发酵方式对药渣中营养成分的改变以及乙醇提取物和水提取物抑菌效果及抗病毒效果的差异。采用肉汤稀释法测定药渣发酵前后不同提取物对猪副嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)、猪链球菌二型(Streptococcus suis type 2,SS2)、肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)3种致病菌菌株的最小抑菌浓度(MIC);以伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分别感染非洲绿猴肾细胞(Vero)、非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145)、猪肾细胞(PK-15),通过荧光显微镜观察细胞形态病变,同时结合实时荧光定量PCR技术进行病毒核酸检测和定量作为药物体外抗病毒效果的评价指标。结果表明,连花清瘟原药渣的乙醇和水提取物对HPS和SS2均表现出抑制作用,但对ETEC无抑制作用;对3种试验病毒均表现出抗病毒活性,但抗病毒活性存在一定区别。发酵后乙醇和水提取物增强了抗菌抗病毒活性,同时对ETEC表现出抑制作用。综上表明,连花清瘟药渣提取物具有不同程度的抗菌、抗病毒作用,能有效抑制猪养殖过程中HPS、SS2等常见的致病菌和病毒,发酵后能增强抗菌和抗病毒效果,具有开发成动物饲料或饲料添加剂的潜力。

犬瘟热病毒N和H蛋白拮抗IFN-β信号通路的研究

为研究犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)不同毒株N、H蛋白调控宿主β-干扰素(IFN-β)表达的作用,将CDV野毒株LN(10)1、SD(14)7和疫苗株CDV3感染提前转染了pGL3-IFN-β报告基因质粒和pRL-TK内参质粒的MDCK细胞,分别在感染0 h、8 h、12 h和24 h后通过双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定IFN-β启动子的活性。将CDV野毒株LN(10)1、SD(14)7和疫苗株CDV3 N和H基因克隆到pCI真核表达载体。重组表达质粒分别转染HEK293T细胞,应用Western blot检测蛋白能否正确表达。将N和H蛋白重组表达质粒连同pGL3-IFN-β报告基因质粒和pRL-TK内参质粒共转染至HEK293T细胞后,经Poly(I:C)刺激细胞,利用双荧光素酶报告系统检测系统测定IFN-β启动子活性。结果显示3种不同毒力的CDV在感染MDCK细胞后,只有CDV 3疫苗株感染后能观察到IFN-β启动子短暂激活。Western blot实验证实,3种毒株N和H蛋白在HEK293T细胞中均能正确表达。双荧光素酶报告系统对IFN-β启动子检测活性结果显示,Poly(I:C)成功激活了IFN-β信号通路,而这种激活作用在表达CDV不同毒株的N或H蛋白时均受到显著抑制(P <0.01),但不同毒株N或H蛋白对IFN-β信号通路的调控与CDV毒力无关。本研究证实了CDV野毒株和疫苗株N、H蛋白可抑制宿主IFN-β信号通路,为进一步研究CDV与宿主分子互作奠定基础。

酵母硒对不同生理时期梅花鹿血清生化指标的影响

本研究旨在通过考察不同生理学时期梅花鹿血清生化指标的动态变化,阐明酵母硒对其血清生化指标的影响。选取20头体况相近、5岁健康的雄性梅花鹿,随机分为4组,每组5个重复,每组单圈饲养,分别饲喂在基础饲粮基础上添加0 mg/kg(Ⅰ组,对照组)、0.3 mg/kg(Ⅱ组)、1.2 mg/kg(Ⅲ组)、4.8 mg/kg(Ⅳ组)硒元素的饲粮,硒源为酵母硒(硒含量为2000 mg/kg)。预试期7 d,正试期110 d。结果表明,1)Ⅰ组梅花鹿的血清葡萄糖浓度在8月份时极显著高于5月份(P<0.01),显著高于6月份和7月份(P<0.05);2)Ⅰ组梅花鹿血清尿素氮浓度在5月份时显著高于7月份和8月份(P<0.05);Ⅱ组梅花鹿血清尿素氮浓度在5月份时极显著高于8月份(P<0.01),梅花鹿血清白蛋白浓度在5月份时显著高于7月份和8月份(P<0.05),血清白蛋白浓度在6月份时显著高于8月份(P<0.05);3)Ⅰ组梅花鹿血清碱性磷酸酶活性在6月份和8月份时极显著高于5月份和7月份(P<0.01),Ⅱ组和Ⅲ组梅花鹿血清碱性磷酸酶活性在6月份时极显著高于5月份和7月份(P<0.01);Ⅳ组梅花鹿血清碱性磷酸酶活性在6月份时极显著高于7月份(P<0.01),显著高于5月份(P<0.05);Ⅳ组梅花鹿血清丙氨酸转氨酶活性在7月份时显著高于6月份(P<0.05)。综上所述,生茸期梅花鹿血清碱性磷酸酶活性高于其他生理时期,0.3 mg/kg和1.2 mg/kg硒添加量组梅花鹿血清碱性磷酸酶含量在6月份达到峰值,酵母硒有提高生茸期梅花鹿血清碱性磷酸酶的作用。

犬瘟热病毒感染雪貂的临床症状及其治疗探究

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的高死亡率的烈性传染病,对宠物、毛皮动物及野生动物有较大的影响。接种疫苗是预防CD的主要措施,但部分动物接种疫苗后仍有发病现象。目前多采用抗病毒和消炎结合的方式对CDV感染发病的动物进行治疗,但药物搭配方案需要优化以发挥更好的治疗效果。为了评估感染CDV后发病特点和治疗方案,该研究通过CDV感染后临床症状赋分标准设置、淋巴细胞数和排毒时间检测、病变观察以及治疗效果评价,建立了雪貂CDV感染的临床症状指标体系。试验结果显示,雪貂体重变化率在接毒后第8天超过10%(P<0.05);第5~14天直肠温度39.5~40.0℃;第9天发现脓性分泌物;少量红疹第8天出现;第7天后出现食欲废绝,第9天发现抽搐、转圈等神经症状;第6天发现腹泻,第7天发现呕吐,第9天出现便血。犬瘟热症状分数在接毒后0~3 d、4~6 d、7~9 d、10~14 d分别为0.5、6、12.25和14。雪貂淋巴细胞数在第7天下降到2.2×10^(3)/μL(P<0.05)。从第3天开始排毒直到试验结束。剖检可见脑轻微出血、肝肿胀和出血、脾充血、肺红肿并充血、肾肿大并发炎、肠有出血。经CDV抗体血清(0.5 mL,1次/d)、拜有利(0.1 mL,1次/d)、安乃近(0.5 mL,2次/d)、盐酸肾上腺素(0.1 mL,休克时使用)、维生素B_(1)和维生素B_(12)(0.5 mL,1次/d)联合给予的方式治疗感染雪貂,结果显示症状在治疗11 d后消失。以上研究结果表明,雪貂感染CDV后临床症状程度与淋巴细胞数、排毒和剖检结果相关,该研究选用的治疗方案对CDV感染雪貂有较好的治疗效果,为雪貂犬瘟热感染的早期诊断和治疗提供重要的参考。

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。

犬瘟热病毒SD(14)7株对比格犬的致病性研究

对3~4月龄比格犬经肌肉注射方式接种犬瘟热病毒(CDV)SD(14)7株1 mL(病毒含量为106.0 TCID50/mL),并进行体温、淋巴细胞数、眼鼻直肠排毒和组织病毒含量及分布等指标检测,评价变异株SD(14)7对比格犬的致病水平。结果显示,CDV感染后第2天比格犬出现CDV感染的典型特征,如眼和鼻分泌物增多,淋巴细胞明显减少,然而动物的体温变化无明显的“双相热”特征。CDV定量检测结果显示,比格犬攻毒后第10天开始通过眼鼻和直肠向外界排毒,CDV在脾中含量最高。病理剖检可见脾有坏死、肺炎症出血等,病理组织HE和免疫组织化学检测发现脾有严重的充血,淋巴细胞中有CDV抗原,证实该毒株主要感染淋巴组织和器官。此外,比格犬大脑部分神经细胞严重肿胀,在脑中可检测到CDV,表明SD(14)7株具有一定的神经嗜性。本试验结果为进一步鉴定犬瘟热病毒感染比格犬的毒力因子和免疫原性以及疫苗免疫效果的评价奠定了基础。