嵌合流行毒株G-H环基因重组口蹄疫病毒的拯救及其免疫原性分析

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的疫苗候选株,本研究利用FMDV反向遗传操作技术,通过基因替换,构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆,转染表达T7RNA聚合酶的细胞后拯救重组FMDV,分析结构蛋白基因的重构对病毒生物学特性的影响;拯救病毒制备灭活疫苗,免疫猪和牛,用体外中和试验初步研究其作为O型FMD疫苗候选株的潜力。结果表明FMD流行毒株结构蛋白VP1 G-H环基因的替换没有明显影响重组病毒的噬斑表型和复制能力,但不同FMDV G-H环抗原表位对猪诱导机体产生交叉中和抗体水平影响较大,对牛诱导机体产生交叉中和抗体的影响较小,表明FMDV G-H抗原表位是猪免疫优势的表位。本研究为未来FMDV疫苗的设计提供了重要参考。

口蹄疫灭活疫苗的免疫效果及其对鉴别诊断的干扰

灭活疫苗免疫是防控口蹄疫的重要措施,但是灭活疫苗的免疫效果及其对感染与免疫鉴别诊断的干扰一直是口蹄疫免疫无疫区建设评估需要明确的重要问题。本研究中选择了3个企业(代号A、B与C)的4组口蹄疫O型与A型二价灭活疫苗,分别免疫口蹄疫抗体阴性健康未成年牛,免疫3~4次,测定免疫前后结构蛋白和非结构蛋白抗体的应答水平。结果显示:(1)结构蛋白抗体合格率:a1组(A企业多批次疫苗)4次免疫后O型和A型均为100%;a2组(A企业同批次疫苗)一~三免O型为36.7%、98.3%与100%,A型为15%、86.7%与100%;b组(B企业疫苗)一~三免O型为18.3%、97%与100%,A型为1.7%、45%与53.3%;c组(C企业疫苗)一~三免O型为26.7%、96.7%与100%,A型为21.7%、71.7%与100%。(2)非结构蛋白3ABC抗体阳性率(两种方法复核结果):a1组一~四免分别为0.7%、1.4%、9.5%与4.8%;a2组和c组三次免疫均未检测到阳性;b组仅三免后阳性率为0.6%。3组灭活疫苗首次免疫牛的抗体合格率远不及70%,但加强免疫后抗体合格率均显著提高;非结构蛋白抗体检测结果表明有3组疫苗的抗原纯净度符合OIE的要求,但a1组灭活疫苗免疫后,仍然对感染与免疫鉴别诊断存在干扰;采用两种非结构蛋白抗体检测方法进行复核检验,可以提高感染与免疫鉴别诊断的准确性。本研究为口蹄疫免疫无疫评价方案的制定提供了科学依据。

A型塞内卡病毒HBWH/1/2018株的分离鉴定及全基因组序列测定

为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原,本研究采用RT-PCR、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序列的测定。结果表明:成功分离到1株A型塞内卡病毒(SVA),命名为HBWH/1/2018株。该毒株接种BHK-21细胞培养能够引起明显的致细胞病变效应;免疫荧光试验结果为阳性;病毒滴度为10^(9.35) TCID_(50)/0.1mL;该毒株基因组全长7281 bp(不包括Poly A),开放阅读框为6546 bp,编码2181个氨基酸;VP1核苷酸序列的遗传进化分析表明HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系最近(相似性高达99.4%),而与SVA原型毒株SVV-001株的亲缘关系最远(相似性为91.3%)。本研究不仅丰富了SVA的分子流行病学数据,也为进一步研究SVA的致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础。

毛乌素沙地典型人工林土壤水分特征及其对降水的响应

降水格局的波动影响着干旱半干旱区生态系统的稳定性。以毛乌素沙地典型人工林杨柴、沙柳及流动沙丘(对照)为研究对象,通过连续监测降水与土壤含水量变化,分析3种覆被类型10,30,50,70,90,110 cm处土壤水分时空特征及对不同降水量级的响应。结果表明:1)从浅层至深层土壤水分含量流动沙丘呈“S”型变化,杨柴人工林呈“3”型变化,沙柳人工林呈持续增大。2)5—10月植被生长季土壤水分变化,流动沙丘呈波动性变化,杨柴人工林呈“M”型变化,沙柳人工林呈“N”型变化。3)土壤水分对降水响应敏感度流动沙丘>沙柳人工林>杨柴人工林。4)降水量相同时,土壤水分补给对降水的响应具有滞后性,土壤初始含水量及降水强度影响水分入渗深度。结果为干旱半干旱区生态建设过程中降水补给下有效的水资源利用及土壤水分预测提供理论依据。

一类调查与二类调查森林蓄积量数据对接方案分析研究

我国一类调查(森林资源连续清查)与二类调查(森林资源规划设计调查)两种监测体系因调查目的及方法不同,因此监测获取的森林资源数据存在不一致。鉴于此,以保定市为例,开展一类调查与二类调查森林蓄积量数据对接方案分析研究。采用非线性指数模型分树种组构建小班蓄积量预估模型,通过模型反演更新调整保定市内所有小班蓄积量信息,从而获取保定市各县(市、区)森林蓄积量信息;采取平差调整法实现保定市一类调查与二类调查蓄积量监测值对接。研究结果显示:1)分树种组研建的小班蓄积量预估模型评价指标均表现较好,表明模型具有较好的预估能力;2)相比二类调查而言,采用小班蓄积量预估模型监测获取的保定市森林单位蓄积量(34.98 m^(3)/hm^(2))与一类调查蓄积量监测值对比,其精度为91.06%,较大程度上降低了相对误差,表明了小班蓄积量预估模型监测值的可靠性;3)对模型预估值进一步进行平差调整后,最终实现了一类调查与二类调查蓄积量监测成果对接,表明了研究方案的可行性。可见,研究的技术方案可为各省级行政区历年小班蓄积量监测数据对接更新及今后实现“一套数,一张图”提供技术方法参考。

一株多谱系重组NADC34-like-PRRSV的分离鉴定及其基因组特征分析

本研究2021年9月从甘肃规模化猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪肺脏组织和血清,经(Open Reading Frame 5,ORF5)基因分型RT-PCR扩增测序鉴定,阳性样品进行病毒分离。经间接免疫荧光试验和感染细胞病理电镜切片鉴定分离毒株,采用RTPCR方法对PRRSV分离株进行全基因组序列扩增,利用生物学软件分析其遗传演化特征,同时也对该场107份猪血清样本检测。研究结果显示,ORF5基因分型RT-PCR扩增测序结果表明,该猪场为NADC34-like-PRRSV感染;间接免疫荧光显示能够与PRRSV N蛋白单克隆抗体(SR30)反应,电镜观察到感染细胞中直径大小为50-80 nm病毒粒子,其基因组全长大小为15078 bp,将分离株命名为PRRSV GSJT/9/2021株。分离株与不同谱系代表株VR-2332、JXA1、HuN4、NADC30和NADC34的全长核苷酸序列同源性分别为85.2%、86.4%、86.5%、88.7%和85.9%;ORF5基因序列与代表毒株ORF5基因序列及编码氨基酸序列的相似性分别为83.7%~94.9%与84.6%~95.5%,其中与IA/2014/NADC34毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高分别为94.9%和95.5%;基于GSJT/9/2021全基因组和ORF5基因分别构建进化树对分离株进行分型,结果显示GSJT/9/2021的全基因组与类NADC30毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而ORF5基因遗传进化树表明GSJT/9/2021毒株与类NADC34毒株亲缘关系最近;ORF5氨基酸序列分析结果显示,ORF5的变异程度最大,GP5蛋白中4个糖基化位点与国内流行的NADC34毒株相比额外增加一个糖基化位点第57位,在诱骗表位37-45 aa中第38、39位出现独特突变(H38Q,L39F);Nsp2氨基酸序列分析结果显示,Nsp2蛋白存在“111+1+19a”(323-433位、483位、504-522位)缺失模式,与NADC30毒株缺失模式一致;重组分析表明GSJT/9/2021株由NADC30-like PRRSV、HUN4与IA/2014/NADC34之间发生重组变异而来,重组位点分别位于Nsp4、Nsp9、GP2a和M的氨基端。107份血清的PRRSV N蛋白抗体阳性率达98.2%。综上,PRRSV GSJT/9/2021株是1株多谱系重组变异NADC34-like-PRRSV,通过深入解析重组毒株的遗传变异和生长特性,为甘肃地区防控PRRS具有重要的指导意义。

2020—2023年甘肃猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因遗传变异分析

为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及遗传变异情况,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对2020-2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序,通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传变异分析。结果显示,共检测了52份猪临床样品,PRRSV核酸阳性率为61.5%(32/52),成功获得了32条ORF5、15条NSP2和14条ORF3基因序列。ORF5基因遗传进化分析表明,2020—2023年甘肃地区猪群中PRRSV流行毒株中存在美洲型1.5谱系(4株)、1.8谱系(24株)、5.1谱系(2株)、8.7谱系(2株);NSP2基因遗传进化分析表明,获得的15条NSP2序列均为1.8谱系;ORF3基因遗传进化分析表明,获得的14条ORF3序列包括1.5谱系(2株)、1.8谱系(11株)、3.5谱系(1株)。基因核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF582.3%~99.7%、NSP285.9%~90.0%和ORF389.8%~95.7%;基因编码氨基酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF579.6%~99.0%、NSP283.4%~87.7%和ORF385.1%~94.5%。ORF5基因编码的GP5蛋白的信号肽区、高变区、细胞表位区等区域均存在不同程度的变异,其中5株毒株的第33位氨基酸出现了缺失;15株NSP2蛋白氨基酸序列的缺失模式与NADC30株一致。上述结果表明,当前甘肃地区猪群中PRRSV呈现以1.8谱系毒株为优势的美洲型多谱系共循环流行,这对甘肃地区防控PRRSV提供了重要的流行病学数据。

一株羊肠道病毒的分离鉴定及其基因组特征分析

本研究利用宏基因组测序技术,从死亡湖羊淋巴组织中检测出小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染,为了分离羊肠道病毒,采取病毒总RNA转染BHK21细胞方法,连续传代后,通过致细胞病变、测序、TCID_(50)测定和病毒一步生长曲线、电镜观察等鉴定分离出病毒,并与参考毒株比对分析分离病毒的基因特征。结果显示,转染病毒总RNA的BHK21细胞传至第2代就出现了明显的致细胞病变效应,测序证明培养物中仅含羊肠道病毒,其基因组全长为7446 nt,其中5′UTR长821 nt,3′UTR长109 nt,ORF长6516 nt,与参考毒株比较可划分为G种肠道病毒,病毒粒子大小为20~30 nm,第6代细胞毒感染8 h时TCID_(50)值最高,为10^(-4.2)/0.1 mL,命名为JSNT/1/2022株。本研究首次利用组织病料RNA转染细胞的方法成功分离出1株羊肠道病毒,说明羊肠道病毒核酸具有感染性,为羊肠道病毒的分离鉴定探索了一种更为可靠的方法,也为羊肠道病毒相关基础与应用研究奠定了病原学基础。

口蹄疫O型重组病毒的构建及其免疫原性分析

【目的】利用反向遗传操作技术,构建含O型口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)3个拓扑型免疫优势结构蛋白基因的重组FMDV,评估其作为猪O型口蹄疫(food-and-mouth disease,FMD)疫苗候选株的潜力。【方法】通过基因合成,在FMD疫苗株O/HN/CHA/93(古典中国拓扑型)的基因中嵌合流行株O/NXYCh/CHA/2018(东南亚拓扑型)VP1结构蛋白的重组病毒骨架上,用O/TUR/5/2009疫苗株(中东-南亚拓扑型)VP1蛋白的G-H环基因替换其对等基因,构建含O型3个拓扑型FMDV结构蛋白基因的重组全长质粒,Not I线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救重组病毒。通过RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定重组病毒;噬斑试验和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。重组病毒制备疫苗免疫猪,用病毒中和试验分析其对当前流行的O型3个拓扑型FMDV的交叉反应性。【结果】成功拯救到含O型3个拓扑型FMDV结构蛋白基因的重组病毒,重组病毒与亲本病毒具有相似的生物学特性。亲本病毒和重组病毒制备的疫苗免疫猪,均能够对中东-南亚型(Middle East-South Asia,ME-SA)拓扑型和东南亚型(South-East Asia,SEA)拓扑型病毒株产生保护性平均中和抗体(>1.65log10);均不能对古典中国型(Cathay)拓扑型流行株产生保护性平均中和抗体(<1.65log10),但与亲本病毒相比,O/TUR/5/2009疫苗株G-H环基因的替换显著提高了对ME-SA和SEA拓扑型病毒株的交叉反应性(P<0.05)。【结论】本研究对未来FMD疫苗的设计具有重要的指导意义。

骆驼FGF21蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在为深入研究骆驼成纤维细胞生长因子21(FGF21)调节糖脂代谢的作用机制提供蛋白和抗体材料。在NCBI数据库中检索骆驼FGF21基因序列(XM_010996368.2),删除信号肽区段后合成携带His标签的FGF21全长基因,通过Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切位点嵌入p ET-28a(+)表达载体,获得重组表达质粒p ET-28a(+)-FGF21-His,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行重组蛋白FGF21的表达,通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。将重组蛋白FGF21与弗氏佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔,制备家兔源多克隆抗血清,利用protein A亲和层析纯化柱纯化多克隆抗体,利用SDS-PAGE技术分析纯化多克隆抗体的纯度,利用Western-blot和间接ELSIA方法验证纯化多克隆抗体的反应性。结果表明,成功表达并纯化出骆驼重组蛋白FGF21,以其免疫家兔后制备并纯化出抗FGF21的特异性多克隆抗体。本研究为建立ELISA方法检测骆驼FGF21蛋白提供了材料,为阐明FGF21在骆驼糖脂代谢中的功能机制奠定了基础。

一起荷斯坦奶牛乳头瘤病诊断及其病毒基因型分析

牛乳头瘤病毒是一种能够引起牛发生皮肤乳头状瘤、纤维素瘤、膀胱和食道癌的DNA病毒,现已在牛群中广泛传播,对牛养殖业造成了重大经济损失。为了诊断甘肃某荷斯坦奶牛场300多头泌乳期奶牛乳头突发疣状物的病因,本研究采用流行病学调查、临床观察、组织病理学、分子生物学检测方法和基因测序技术,对患有疣状物的奶牛进行综合诊断。结果表明,乳头患疣状物奶牛的其它部位无类似生长物,无发烧、疼痛等异常临床症状,组织病理学HE检测疣状物呈现角化过度和细胞空泡化现象,这与牛乳头瘤病毒感染的组织病理变化相似,并且用PCR方法获得了牛乳头状瘤病毒L1基因,测序比对结果显示为乳头瘤病毒7型基因,核苷酸同源性达98%以上。因此,本次荷斯坦奶牛乳头突发疣状物为乳头瘤病毒7型感染引起的,这是甘肃地区首次发现该基因型乳头瘤病毒,应引起奶牛场与防疫部门的重视。

Infective viruses produced from full-length complementary DNA of swine vesicular disease viruses HK/70 strain

The full-length cDNA clone of swine vesicular disease virus HK/70 strain named pSVOK12 was constructed in order to study the antigenicity, replication, maturation and pathogenicity of swine vesicular disease virus. In vitro transcription RNA from pSVOK12 transfected IBRS-2 cells and the re- covered virus RNA were isolated and sequenced, then indirect hemagglutination test, indirect im- munofluorescence assays, eleectron microscope test, 50% tissue culture infecting dose (TCID50) assays and mouse virulence studies were performed to study the antigenicity and virulence of the recovered virus. The result showed that the infectious clones we ob- tained and the virus derived from pSVOK12 had the same biological properties as the parental strain HK/70. The full-length infectious cDNA clone, pSVOK12, will be very useful in studies of the anti- genicity, virulence, pathogenesis, maturation and replication of SVDV.

基于全球土地退化零增长监测体系构建的中国沙化土地监测体系及效果评估

土地荒漠化是非常重要的生态环境问题,而科学评价荒漠化治理和零增长目标是否实现的必要前提是具有完善统一的评价体系。为此,联合国防治荒漠化公约(UNCCD)提出了土地退化零增长(LDN)的概念和监测指标。防治土地退化是中国的重要生态目标,中国已开展了多次全国土地荒漠化和沙化监测工作。但是,如何将这些监测结果用于土地退化的评估实践,尚未见报道。因此,本研究针对中国四大沙地,利用3期全国荒漠化和沙化监测数据,与基于UNCCD框架体系下的土地退化零增长(LDN)指标进行对比分析,并基于土地沙化程度变化趋势提出了中国沙化土地退化指标体系(CSLDN)。结果表明:UNCCD所提出的LDN监测指标与中国的荒漠化监测数据总体精度为0.51,中国沙化土地监测指标与LDN指标具有宏观一致性。此外,经本地优化后的CSLDN指标克服了低植被盖度区域LDN对土地退化和恢复的评价不准确的问题,更准确刻画了精细尺度空间内的土地动态变化状况,对土地退化防治意义重大。