携带OPCML基因的慢病毒表达质粒的构建

目的:建立携带和表达OPCML基因的慢病毒(lentiviral viruses,LV)表达质粒。方法:用内切酶将OPCML基因从已构建的表达质粒pcDNA3-OPCML上切下,插入慢病毒载体pWPI-GFP中,构建慢病毒表达质粒pWPI-OPCML,通过酶切、测序和检测验证OPCML蛋白后,将pWPI-OPCML、pCMV-dR8.74和pMDG共转染包装细胞293T,获得重组慢病毒,再感染靶细胞A2780,通过检测标志蛋白-绿色荧光蛋白(GFP)和目的蛋白OPCML进一步验证pWPI-OPCML在细胞中OPCML的表达。结果:(1)pWPI-OPCML中携有正确的OPCML基因,并能在人类细胞中表达;(2)pWPI-OPCML共转染包装细胞293T能产生重组病毒;(3)目的基因OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞A2780,并达到稳定的表达,转导效率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到OPCML和GFP蛋白在靶细胞中的表达。结论:pWPI-OPCML能在人细胞中表达OPCML蛋白,共转染包装细胞获得的重组慢病毒能感染人细胞,作为转基因的工具,具有高效性。

OPCML基因的克隆

目的:建立OPCML真核细胞表达质粒。方法:利用计算机软件Vector NTI,根据GenBank中OPCML的序列,用RT-PCR法从小鼠大脑组织中扩增OPCML基因全长片段,将其克隆入真核细胞表达质粒pcDNA3,建立OPCML的表达质粒pcDNA3-OPCML,后将其转染入人胚胎肾细胞(293T),用Western blot检测OPCML蛋白在293T中的表达。结果:OPCML能被成功地从正常组织中克隆,构建了真核细胞表达质粒pcDNA3-OPCML,测序表明其携带有正常OPCML的全长序列;转导入人类细胞后有OPCML蛋白的高量表达。结论:pcDNA3-OPCML携带有正常的OPCML全长基因序列,其能在真核细胞中高量表达功能蛋白。

重组慢病毒介导的OPCML基因的体外转导及其对卵巢上皮性癌细胞的抑制作用

目的探讨重组慢病毒介导的体外转导OPCML基因的可行性及其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的抑制作用。方法采用PCR技术,用基因特异性引物将OPCML基因的cDNA从CD1小鼠脑组织中扩增,并将OPCML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI GFP上,构建慢病毒载体表达质粒pWPI OPCML;将pWPI OPCML或pWPI GFP(空载体对照)质粒和包装质粒pCMVdR8.74、pMDG共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OPCML和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒WPI OPCML或仅携带GFP基因的重组慢病毒WPI GFP;用重组慢病毒WPI OPCML和WPI GFP分别转导靶细胞,即人卵巢癌细胞系A2780、OCC1细胞和小鼠正常卵巢上皮细胞系CD1细胞,以未转染任何基因者为空白对照。通过细胞增殖实验、细胞聚合力实验、细胞周期分析和体内成瘤实验观察OPCML基因对卵巢癌细胞的抑制作用。结果(1)OPCML基因能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达100%,并稳定表达;蛋白印迹法检测显示,靶细胞中OPCML和GFP蛋白均有表达。(2)细胞增殖实验显示,A2780细胞中,转导OPCML基因72h后的A2780/OPCML细胞为(7.6±1.0)×105个,明显少于未转导基因的A2780细胞或仅转导空载体的A2780/pWPI细胞[分别为(20.0±2.6)×105和(18.1±1.7)×105个;P<0.01];但OCC1和CD1细胞中,OPCML基因对细胞的增殖无明显的影响(P>0.05)。(3)细胞周期分析显示,OPCML基因对A2780细胞的细胞周期有明显的阻滞作用(转导前、后G0～G1期细胞分别为67%、75%;P<0.05),但对OCC1、CD1细胞则无明显阻滞作用(P>0.05)。(4)细胞聚合力实验显示,与空载体对照相比,OPCML基因能明显增强细胞的黏附力(P<0.05)。(5)移植瘤实验显示,将A2780/OPCML细胞注射到裸鼠皮下,4只裸鼠中仅1只裸鼠有肿瘤生长,其肿瘤重量为10mg,显著低于注射A2780、A2780/pWPI细胞的裸鼠[各4只裸鼠均有肿瘤生长,其肿瘤重量分别为(280±53)及(677±323)mg;P<0.01]。免疫组化法检测显示,肿瘤组织中OPCML蛋白有表达。结论用重组的慢病毒载体作为转基因的工具,具有高效性,同时能使目的基因达到持续稳定的表达。OPCML基因能够增加A2780细胞的黏附能力,抑制A2780细胞的增殖和体内成瘤,提示OPCML基因可能是一个新的抑癌基因。

c-myc和K-ras对小鼠卵巢上皮细胞体外转化和体内致瘤的研究

目的探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用。方法用逆转录病毒转基因系统,将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因先后导入小鼠卵巢上皮(MOSE)细胞,建立表达c-myc和K-ras基因的细胞株,分别称为MOSE-Myc细胞、MOSE-Ras细胞和MOSE-RM细胞。通过细胞增殖实验、克隆形成实验、体外侵袭实验以及体内成瘤实验,研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变及恶性转化。结果c-myc和K-ras基因容易被重组逆转录病毒导入MOSE细胞,转导后靶细胞内分别有相应的c-myc或K-ras mRNA转录,以及相应的c-myc(62 000)和K-ras(21 000)蛋白的表达。MOSE-Ras组和MOSE-RM(MOSE-Ras／Myc)组细胞增殖能力显著强于MOSE和MOSE-Myc组(P<0．01),MOSE-RM组细胞增殖能力显著强于MOSE-Myc组(P<0．05)。MOSE-Ras和MOSE-RM组在软琼脂培养中均能形成克隆集落,而MOSE组和MOSE-Myc组不能形成克隆集落。MOSE-Ras组和MOSE-RM组能够穿透Matrigel,具有侵袭能力。MOSE-Ras组和MOSE-RM组细胞在裸鼠体内形成肿瘤,且肿瘤组织细胞仍然可见有K-ras和c-myc蛋白的表达;而MOSE组和MOSE-Myc组无肿瘤形成。结论重组逆转录病毒载体作为转基因的工具,转导效率高,可稳定表达,可以感染正常的细胞;突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc作为一个核转录调节因子,不能使MOSE发生恶性转化,但可协同其他因子,加强其他因子的功能。