北京某绿地蚊媒病毒的分离和鉴定

为了解北京某绿地蚊媒病毒的分布情况,本试验使用诱蚊灯捕蚊采集到蚊虫标本19000余只,利用蚊子细胞C6/36培养进行病毒分离,利用高通量测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定分离株;RT-PCR测定分离株病毒的序列,并与国内外相应病毒序列进行比对分析。结果显示,样本经病毒分离获得2株可引起明显细胞病变的分离株,分别命名为BJ2021/01和BJ2021/02。高通量测序和RT-PCR检测结果显示,BJ2021/01分离株含有版纳病毒(BAV)、忍者病毒(SHTV)、沙捞越病毒(SWKV)和库蚊源类芜菁黄花叶病毒科病毒(CuTLV),为4种病毒的混合物;BJ2021/02为BAV。基因序列分析结果显示,BAV分离株BJ2021/02的12个片段与国内外BAV分离株的核苷酸同源性为58.1%~98.7%,编码氨基酸的同源性为54.4%~98.9%。系统进化分析结果显示,BJ2021/02分离株属基因A型。本试验结果丰富了我国BAV的基因组序列,为开展北京市BAV的流行病学研究提供了参考,为虫媒病毒病的预防和控制提供了病原学依据。

H9N2亚型禽流感病毒感染鸡红细胞引起白细胞介素的免疫应答

为研究H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)感染鸡红细胞后白细胞介素(ILs)参与的免疫应答反应,进一步揭示鸡红细胞在感染H9N2亚型禽流感病毒中所发挥的免疫调节作用,应用实时荧光定量PCR技术分别对体外感染H9N2 AIV后0、2、6、10 h和体内攻毒3、7、14 d后8种白细胞介素相关基因(IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-34)的表达水平进行检测。结果表明,8种ILs相关基因均在鸡红细胞中表达,其表达水平在体外感染H9N2 AIV后和体内攻毒后呈现动态变化;与对照组相比,体外感染H9N2 AIV后不同时间点IL-6和IL-18的相对表达量呈现逐渐升高的趋势,而IL-7、IL-12、IL-15的相对表达量呈现逐渐下降的趋势;IL-13在感染H9N2 AIV后的0、6 h显著下降,而IL-16仅在感染H9N2 AIV后的2 h显著下降。体内攻毒后的不同时间点,IL-12、IL-13、IL-15、IL-16的相对表达水平均逐渐升高,而IL-6、IL-18、IL-34的表达水平先升高后降低,仅IL-7表达水平先降低后升高。综上,鸡感染H9N2 AIV后红细胞发生了相应的免疫应答反应,并通过促炎因子以及抗炎因子的表达来调节鸡感染H9N2后的免疫应答。

6株高致病性H5N6禽流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

目的对活禽市场家禽中分离的H5N6禽流感病毒(avian influenza virus,AIVs)进行遗传进化和分子特征分析。方法2018年12月于乌鲁木齐市活禽市场采集家禽双腔拭子和环境样本,通过接种鸡胚、血凝试验和RT-PCR等方法分离鉴定AIVs,以甲型流感病毒通用引物扩增病毒全基因组并测序,利用BLAST、Clustal W、MEGA-X和DNAStar等软件进行序列比对、系统进化和分子特征分析。结果从家禽样品中分离到6株H5N6亚型AIVs,其各基因之间的一致性较高(99.4%~100.0%),为同一来源。BLAST分析显示除NP基因与苏州家禽中分离的H5N6毒株一致性最高(99.7%),其余7个基因片段均与2017—2018年广东环境中分离的H5N6毒株一致性最高,在99.0%~100.0%之间。遗传进化分析显示分离株的HA属于Clade2.3.4.4.C分支,HA、NA、PB1、PA、NP、MP这6个基因均与2018年自华东地区水貂中分离的H5N6病毒株聚在同一分支,PB2和NS均与2017—2018年于广东环境中分离的H5N6病毒株聚在一起。分离株HA的裂解位点含多个连续的碱性氨基酸,为高致病性AIV,HA的S137A和T160A突变可增强病毒与人源受体SAα2,6-Gal的结合。另外,NA茎部缺失、PB2的L89V、G309D、R477G、I495V、I504V、D391E和A661E以及NS1的P42S、D92E和80~84位氨基酸缺失等突变均可增强病毒对哺乳动物的毒力和致病力。结论分离的6株高致病性H5N6 AIVs与2017—2018年分离自华东地区水貂和广东环境的H5N6 AIVs的遗传关系较近,存在的多个突变可增强病毒对哺乳动物的致病性,存在较大的公共卫生风险。

抗非洲猪瘟病毒噬菌体展示单克隆抗体的筛选及表达

为构建抗非洲猪瘟病毒(ASFV)噬菌体单链抗体文库,并获得抗ASFV的单链抗体,本试验利用自然感染ASFV猪的外周血淋巴细胞提取的mRNA,反转录获得cDNA后分别扩增出猪IgG抗体重链和轻链的可变区基因,构建scFv单链抗体后连接至pComb3XSS载体,构建噬菌体抗体展示文库,经过3轮"吸附、洗脱、富集"的筛淘过程,成功获得1株能够与ASFV蛋白特异性结合的抗体,并验证了该抗体的反应能力。根据筛选得到的可变区序列构建完整抗体使用HEK293A细胞进行真核表达与验证。结果表明,成功构建了库容量约为9.2×10^(11)PFU/mL抗ASFV噬菌体单链抗体文库,筛选并得到1株与ASFV病毒蛋白亲和性较高的单链抗体,使用真核表达系统成功表达了该株重组抗体。该研究为ASFV的诊断和治疗奠定了一定基础。

天山北麓野鸟源H1N1禽流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析

目的对2018年候鸟迁徙季从天山北麓分离的1株野鸟源H1N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIVs)进行全基因组测序及遗传进化分析。方法2018年11月于天山北麓中段多个水库采集320份新鲜野鸟粪便样品,通过接种鸡胚、血凝抑制试验和AIVs PB1通用引物的RT-PCR等方法分离鉴定AIVs,以甲型流感病毒通用引物扩增病毒基因组8个片段并进行全基因组测序,利用BLAST、Clustal W、MEGA7.0和MegAlign等软件进行序列比对、系统进化和分子特征分析。结果从6份野鸟粪便样品中分离鉴定出流感病毒,阳性率为1.88%,其中1株为H1N1亚型AIV,命名为A/wild bird/Xinjiang/010/2018(H1N1)(简称XJ-H1N1)。XJ-H1N18个基因片段均源于雁行目野鸭中分离的AIVs,其中表面基因HA和NA均属欧亚谱系,分别源于蒙古国绿头鸭(Anas platyrhynchos)中分离的H1N1和孟加拉国野鸭中分离的H3N1 AIVs,6个内部基因分别源于俄罗斯西伯利亚地区赤膀鸭(Anas strepera)中分离的H6N8、埃及琵嘴鸭(Anas clypeata)和短颈野鸭(teal)中分离的H7N3以及荷兰绿头鸭等野鸟中分离的H7N5 AIVs。XJ-H1N1血凝素(HA)蛋白裂解位点仅含1个碱性氨基酸,为低致病性AIV。HA受体结合位点190、225位氨基酸为E、G(H3计数),能够结合α2,3半乳糖苷唾液酸(SAα2,3Gal)和SAα2,6Gal双受体。HA的T200A、E227A突变和NS1的P42S突变均可增强病毒在哺乳细胞中的复制能力和致病性。结论从天山北麓野鸟中分离到1株H1N1亚型低致病性AIV,其主要由迁徙野鸭携带的AIVs经多次重配产生,该病毒在哺乳动物细胞中的复制能力和致病力可能增强,可结合SAα2,3Gal和SAα2,6Gal两种受体。

乌鲁木齐市活禽市场环境源H5N8亚型高致病性禽流感病毒的遗传进化分析

为分析新疆乌鲁木齐市活禽市场外环境中禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的遗传特征,于乌鲁木齐市某活禽市场采集环境样品,经接种鸡胚、血凝试验和RT-PCR等方法分离鉴定AIV,病毒全基因组扩增、测序后进行系统进化和分子特征分析。结果显示,从2016年外环境样品分离到2株H5N8 AIVs,其各基因的一致性为85.9%~100.0%,除NA和NS之外的6个基因均聚在不同分支,2株病毒存在差异。同时,2株病毒也存在明显共性,除1株病毒的PB2与山东野鸭中分离的H5N1 AIVs一致性最高并与华东地区家鸭中分离的H5N8 AIVs聚在同一分支之外,其余基因均与2016年底至2017年初自西藏、内蒙古和江苏等地外环境中分离的H5N8 AIVs的相应基因遗传距离最近,并有多个基因与2010-2012年华东地区家鸭中分离的H5N8 AIVs的遗传距离较近。2株分离病毒的HA裂解位点均含5个连续的碱性氨基酸,为高致病性,病毒基因发生的多个突变可增强病毒的毒力和致病力。结果表明,分离的2株高致病性H5N8 AIVs与2016-2017年国内多地外环境以及2010-2012年华东家鸭中分离的H5N8 AIVs的遗传关系较近。

2016年乌鲁木齐市5株高致病性H5N8禽流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

目的对新疆乌鲁木齐市活禽市场家禽中分离的H5N8亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)进行遗传进化和分子特征分析。方法2016年于乌鲁木齐市某活禽市场采集家禽咽和泄殖腔拭子,经接种鸡胚、血凝试验和RT-PCR等方法分离鉴定AIV,以AIV通用引物扩增病毒基因并进行全基因组测序,利用BLAST、Clustal W、MEGA-X和DNAStar等软件进行序列比对、系统进化和分子特征分析。结果从家禽双腔拭子样品分离到5株H5N8 AIVs,其各基因的一致性在99.70%~100.00%之间,说明5株病毒为同一来源,统一命名为XJ-H5N8/2016。系统进化分析表明,该病毒株血凝素基因(HA)、PB2和NS均与2016—2017年湖北、山西和三门峡等地迁徙天鹅以及印度水鸭中分离的H5N8 AIVs聚在一起,同时,3个基因还与国内水貂中分离的H5N6 AIVs以及福建首例人感染H5N6 AIVs聚在一起;神经氨酸酶基因(NA)与2016年印度水鸭中分离的H5N8 AIVs聚在同一终末分支;PB1、MP、PA和NP均与2017年自埃及、喀麦隆、乌干达、刚果等非洲国家野鸟和家禽中分离的H5N8 AIVs聚在一起。XJ-H5N8/2016的HA裂解位点均含5个连续的碱性氨基酸,为高致病性,病毒基因发生的多个突变可增强病毒对哺乳动物的毒力和致病力。结论从活禽市场分离的5株H5N8 AIVs呈高致病性,与2016—2017年湖北、山西、三门峡等地区以及非洲和印度等地迁徙候鸟和家禽中分离的H5N8 AIVs进化关系密切,部分基因还与国内水貂中分离以及感染人的H5N6 AIVs的遗传关系较近,其多个突变可增强AIV对哺乳动物的感染力和致病力,潜在感染人类和威胁公共卫生安全的风险。

非编码RNA调控流感病毒复制的作用及相关机制研究进展

流感病毒是一种重要人畜共患病,严重危害人类健康和畜牧业发展。A型流感病毒(Influenza A Virus, IAV)在宿主细胞内的复制受到多种因素的影响和调节,近年来的研究证明,非编码RNA(ncRNA),包括miRNA、LncRNA、CirRNA等,在流感病毒复制过程中起到重要的调控作用。ncRNA调控流感病毒复制有直接途径和间接途径两种,其中直接途径为直接作用于病毒的vRNA或mRNA,在转录或翻译水平影响病毒的复制。间接途径为作用于细胞内不同的信号通路,通过影响细胞因子合成、诱导宿主细胞凋亡、引起细胞自噬反应等途径,影响病毒的复制。通常情况下,由宿主编码的ncRNA能够抑制病毒的复制,而由病毒编码的ncRNA能够减弱宿主细胞的抗病毒反应,促进病毒复制。通过总结和梳理近年来关于ncRNA调控流感病毒复制的研究,我们发现ncRNA能够作为调控增强宿主细胞抗病毒免疫、下调病毒转录和翻译的工具,有望开发成为抗流感病毒靶向药物。后续的机制研究应不局限于某一种或几种ncRNA的作用,而应在ncRNA在宿主细胞内的分泌机制、调控的分子网络等方面进行深层次的探究。

广东及中国香港地区2016年和2017年甲型H3N2流感病毒的分子特征分析

2017年夏季,我国广东及香港地区H3N2亚型流感病毒暴发流行,造成至少430人死亡。为揭示其流行原因,本研究对广东及中国香港地区2016和2017年夏季流行的甲型H3N2流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因的分子遗传特征进行了分析。采集深圳市2017年夏季流感样症状患者的样本进行H3N2病毒的检测及分离鉴定。利用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)扩增病毒HA、NA基因并测序,用于进一步分析;从流感病毒数据库中下载广东及中国香港地区同期流行的H3N2代表毒株进行遗传变异分析。HA基因系统进化分析显示:广东及中国香港地区2016~2017年流行的H3N2病毒与疫苗株均处于同一进化分支,其中2016年流行毒株与疫苗株的同源性(99.1%~99.4%)高于2017年流行毒株(98.3%~99.4%)。HA蛋白氨基酸分析结果显示,广东及中国香港地区2017年流行株在抗原位点A区158和160位氨基酸、受体结合区域的130-loop和220-loop、以及151位糖基化位点与疫苗株相比出现了较高比例突变,而在2016年流行毒株中没有发现。同时,这些位点在中国香港地区流行毒株中的突变频率高于广东地区流行毒株。NA蛋白氨基酸分析显示,所有毒株均未发现神经氨酸酶抑制剂耐药突变,中国香港地区2017年部分流行毒株234位和329位氨基酸糖基化位点消失(比例分别为12.6%和54.8%)。尽管2016年和2017年H3N2疫苗株为同一株病毒,但是2017年广东和中国香港地区的H3N2病毒流行毒株与2016年流行毒株以及疫苗株相比,在HA蛋白的主要抗原位点和受体结合位点均出现不同程度的变异,推测本次H3N2流感病毒暴发流行可能与这些变异相关。

Tigecycline resistance tet(X3)gene is going wild

The emergence of mobile Tigecycline-resistant tet(X3)and tet(X4)is believed to be a global threat to public health.Here,we investigated the prevalence of tet(X3)and tet(X4)in our metagenomic data of migratory birds.While tet(X4)was not identified in our samples,tet(X3)was found in two gut microbiomes of bird fecal samples,with 100%amino acid identity of sites 150–387.These results suggest that tet(X3)has been spreading into the environment for a long period of time and that there is an urgent need to control its further transmission.