三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp,3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸,CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MODEL预测三角帆蚌CypA含有8个β折叠和2个α螺旋,可能形成CypA的活性中心区域。利用MEGA 5.1软件将三角帆蚌CypA与其他物种CypA基因进行序列比对并构建系统进化树,分析发现三角帆蚌CypA与池蝶蚌的CypA聚为一支,其与池蝶蚌CypA具有最近的亲源关系。通过qRT-PCR检测CypA基因在三角帆蚌不同组织中表达,发现三角帆蚌性腺中CypA基因的表达量最高,肝脏、肾和鳃中的表达量次之。对三角帆蚌浸泡感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),CypA基因在肝脏、性腺、肠和鳃中的表达水平在感染72h先升高后降低,其表达量在性腺和鳃中6h最高,肝脏中12h达到峰值,肠中24h达到最高值,表明三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后,可显著诱导CypA基因的表达。CypA基因在性腺中的表达量到达峰值的时间要早于肠与肝脏,且到达峰值时的相对表达量(14.91)也显著高于肝脏(9.89)、肠(9.78)和鳃(7.53),推测CypA在三角帆蚌性腺中具有防御细菌感染的重要作用,三角帆蚌性腺可能不仅具有生殖的功能,同时在免疫防御系统中也发挥着重要的作用。

镉胁迫对团头鲂免疫系统与抗氧化系统的影响

为研究镉暴露对团头鲂免疫系统与抗氧化系统的影响,将团头鲂暴露于浓度为0(对照组)、0.05、0.10和0.50 mg/L镉水体中养殖60d,发现胆囊随镉浓度的增加而变大,在高浓度镉暴露组(0.50 mg/L Cd)胆囊颜色加深变成墨绿色,各镉暴露组团头鲂肝脏体指数与脾脏体指数均显著高于对照组,且脾脏体指数随着镉浓度的增加逐渐升高。团头鲂经0.50 mg/L镉暴露养殖60d,镉在肠中富集含量最高(240±1.41)mg/kg,其次是中肾、肝、鳃、脾、头肾、心、精巢、卵巢和脑,肌肉中镉的含量最低(0.35±0.04)mg/kg。团头鲂经0.50 mg/L镉暴露养殖60d后,与对照组比较,体色偏黄;脾脏肿大,细胞出现空泡;肝脏发黑并有出血的症状,肝窦增宽;肠绒毛长度变短,肠壁肌肉层厚度增大;鳃组织出现动脉瘤,细胞增生,鳃小片发生弯曲。血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和总超氧化物歧化酶(SOD)活性随着镉浓度的增加逐渐降低,溶菌酶(LYS)含量、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及过氧化氢酶(CAT)活性在低浓度镉暴露组显著升高,在高浓度镉暴露组呈下降趋势,且LYS含量、AKP与ACP活性在高浓度镉暴露组(0.50 mg/L)显著性低于对照组。il-6、il-1β、il-10、tnf-α与c3基因在头肾、脾脏及肝脏中的表达量随着镉浓度的增加逐渐降低,肠中tnf-ɑ、c3与igm基因及鳃中c3基因的表达量均随着镉浓度的增加逐渐升高,头肾中igm基因的表达量在低浓度镉暴露组显著升高,在高浓度镉暴露组显著性降低。研究表明,低浓度镉诱导团头鲂表现出一定的毒物兴奋效应,但随着镉浓度增高,团头鲂解毒与免疫相关组织被损伤,机体抗氧化与免疫系统被抑制,镉对团头鲂的抗氧化系统与免疫系统均存在毒性。研究为进一步深入探索镉对鱼类的毒性作用机制提供了基础的实验依据。

凡纳滨对虾WAP基因重组表达及抗病功能分析

【目的】针对凡纳滨对虾白便病的危害现状,克隆其WAP基因并分析其组织表达特性及抗病功能,为凡纳滨对虾抗病药物开发提供参考依据。【方法】设计WAP基因特异性引物,用RT-PCR检测WAP基因在凡纳滨对虾血细胞、眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、胃、肌肉、神经、肠、后盲囊和表皮等11种组织的表达分布情况;采用实时荧光定量PCR检测患白便病凡纳滨对虾鳃和肠道组织的WAP基因表达量;重组表达WAP蛋白,使用ELISA分析其与细菌多糖LPS(脂多糖)、PGN(肽聚糖)和LTA(脂磷壁酸)的结合能力。【结果】WAP基因在11个凡纳滨对虾组织均有表达,其中,以在血细胞中的表达量最高,在表皮、眼柄和肝胰腺的表达量表达较低;WAP基因在感染白便病凡纳滨对虾鳃和肠道组织的表达量显著高于健康凡纳滨对虾(P<0.05),分别为健康凡纳滨对虾的5.9258和1.5147倍;WAP融合蛋白与细菌多糖LPS、PGN和LTA具有直接结合作用,细菌多糖的结合能力表现为PGN>LPS>LTA。【结论】WAP基因与凡纳滨对虾抗病免疫功能密切相关,WAP融合蛋白在开发凡纳滨对虾抗白便病药物方面具有潜在应用价值。

无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响

【目的】分析无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响,为揭示无乳链球菌与肠道菌群的相互作用机制提供参考依据。【方法】以无乳链球菌HN016强毒株的菌悬液经口灌胃吉富罗非鱼,采用实时荧光定量PCR及16S r RNA高通量测序技术分析无乳链球菌在罗非鱼肠道中的定植情况及对罗非鱼肠道菌群结构和多样性的影响。【结果】口服无乳链球菌HN016菌悬液的罗非鱼在24 h后出现链球菌病的典型症状,至口服后第3 d试验组罗非鱼全部死亡;口服12 h后罗非鱼肠道内的无乳链球菌HN016强毒株数量达峰值,但口服24 h后其数量显著下降(P<0.05)。口服无乳链球菌HN016菌悬液后罗非鱼肠道样品OTUs的数量和种类发生明显变化,表现为口服12 h后引起罗非鱼肠道菌群多样性明显降低,但口服24 h后出现反弹并高于初始水平,且肠道菌群多样性与无乳链球菌HN016强毒株在肠道中的含量呈明显负相关。口服无乳链球菌HN016菌悬液引起罗非鱼肠道菌群构成比例发生明显变化,门水平上排名前10位的变形菌门、拟杆菌门、广古菌门、互养菌门和软壁菌门细菌所占比例上升,厚壁菌门、梭菌门、放线菌门、奇古菌门和螺旋体门所占比例则呈下降趋势;在属水平上表现为罗非鱼肠道菌群排名前10位的优势菌属除了拟杆菌属和不动杆菌属呈上升趋势外,其他菌属如鲸杆菌属、乳球菌属和丙酸菌属等均呈下降趋势,即罗非鱼大部分肠道优势菌群已受到无乳链球菌HN016强毒株的抑制。【结论】无乳链球菌感染罗非鱼后肠道菌群构成及其多样性明显改变,可引起致病菌爱德华氏菌属和假单胞菌属细菌比例的增加,同时引起鲸杆菌属、丙酸菌属和乳球菌属等肠道有益细菌比例的减少,故推测迟缓爱德华氏菌和荧光假单胞菌继发感染在罗非鱼链球菌病的发生发展过程中起重要作用。

海豚链球菌LAMP方法的建立及初步应用

为快速准确地检测鱼类海豚链球菌(Streptococcus iniae),减少由其造成的经济损失,建立了一种基于Sim基因高效、敏感的海豚链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并对739个样品进行了检测。结果表明,该方法可以特异性地检测海豚链球菌,而不能检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)等8种参考菌株。对海豚链球菌DNA最低检测限为5.32拷贝/μL;对739个样品的检测结果显示,8种鱼类海豚链球菌的平均检出率为17.67%,池塘水和海水的检出率分别为13.33%、16.67%;该菌主要发现于罗非鱼脑组织中,其平均检出率为27.04%(43/159),而其他鱼类则主要发现于皮肤,平均检出率为24.14%(42/174);阳性样品主要来自于2014年6月至9月期间,占总检出率的65.00%。

酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼生长、非特异性免疫及肠道结构的影响

【目的】探讨酵母多糖-中草药复合制剂对罗非鱼生长、非特异性免疫及肠道结构的影响,为罗非鱼的健康养殖提供理论依据。【方法】在基础饲料中添加3个不同水平的酵母多糖-中草药复合制剂(0.05%、0.10%和0.20%)分别饲养罗非鱼,56 d后测量罗非鱼的生长性能(增重率、特定生长率、饲料系数、存活率)、血清生化指标(总蛋白、球蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶和谷草转氨酶)、血清抗氧化指标(总抗氧化能力、过氧化氢酶、丙二醛和一氧化氮)、血清免疫指标(补体C3、C4,淀粉酶和溶菌酶)、肠道结构(绒毛高度和肌层厚度)。【结果】0.2%组的增重率、特定生长率、白蛋白含量、谷丙转氨酶浓度、谷草转氨酶浓度、总抗氧化能力浓度、过氧化氢酶浓度、补体C3浓度、补体C4浓度、溶菌酶活性和绒毛高度分别比对照组提高6.37%、3.50%、17.42%、31.47%、32.47%、21.29%、121.43%、6.26%、13.06%、19.50%和25.25%,差异显著(P<0.05)。【结论】在罗非鱼饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂,能有效提高罗非鱼的生长性能和非特异性免疫功能,改善肠道结构。

鱼鸭混养池塘罗非鱼无乳链球菌病的病原分离鉴定及其防治

【目的】查明罗非鱼与鸭混养模式下引起罗非鱼发病的主要病原,并探索微生物与中药综合防治的有效方法,为建立安全、高效的鱼鸭混养模式提供科学依据。【方法】从广西南宁市隆安县那桐镇某罗非鱼与鸭混养池塘的发病罗非鱼中取样进行病原菌分离纯化,对获得的纯化分离菌株进行16S rRNA序列测序及人工感染试验和药敏试验,并在药敏试验的基础上采用内服结合外用消毒的方式进行治疗,且在罗非鱼痊愈后使用微生物制剂(成分为芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌等)调节池塘水质,同时给罗非鱼投喂微生物制剂和中药(三黄散、肝胆利康散和黄芪多糖)。【结果】引起罗非鱼与鸭混养池塘中罗非鱼发病的病原菌为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),其对罗非鱼的半数致死浓度(LD50)为4.7×10^6 CFU/mL,对罗红霉素、青霉素、氯霉素、磺胺异恶唑、阿莫西林、利福平、头孢克洛、呋喃唑酮、氟本尼考、头孢氨苄和头孢派酮等抗菌药物高度敏感,对诺氟沙星、庆大霉素和卡那霉素不敏感(耐药)。通过内服氟苯尼考、三黄散、维生素K3和黄芪多糖并全塘泼洒戊二酫与苯扎溴铵混合液及过硫酸氢钾,连续用药14 d后罗非鱼病情基本得到控制。定期泼洒微生物制剂,结合罗非鱼内服微生物制剂和中药的效果良好,即使在高温季节也未出现水质恶化和鱼类发病现象。【结论】引起鱼鸭混养池塘罗非鱼发病的病原菌为无乳链球菌,可采取氟本尼考与三黄散、维生素K3和黄芪多糖联合用药的方法进行治疗。生产上,在鱼鸭混养池塘泼洒微生物制剂及罗非鱼内服微生物制剂和中药,对改善池塘水质及预防疾病发生具有积极作用,能有效降低鱼鸭混养模式下鱼类的发病率。

双棘黄姑鱼源致病发光杆菌的分离与鉴定

【目的】分离鉴定双棘黄姑鱼(Protonibea diacanthus)源致病发光杆菌,为查明引起双棘黄姑鱼出现大批量死亡的病因及科学指导防控该病的规范用药提供参考依据。【方法】对从广西北海市铁山港网箱养殖发病双棘黄姑鱼肾脏中分离到的菌株(编号20210120)进行人工感染试验,确定其是否为双棘黄姑鱼致病菌;并对该菌株进行形态学观察、多基因(gapA、topA、mreB、ftsZ、gyrB和16S rRNA)序列分析及药敏试验。【结果】分离菌株与托鲁尼发光杆菌(Photobacterium toruni)16S rRNA序列在系统发育进化树上聚类为一支,其序列相似性达99.93%,与5个管家基因(gyrB、gapA、topA、ftsZ和mreB)序列的相似性分别为99.50%、99.86%、100.00%、99.83%和99.44%,因此确定菌株20210120为托鲁尼发光杆菌。人工感染双棘黄姑鱼病鱼出现与自然发病相同的病症,且再次从其肾脏中分离到与自然发病相同的细菌。药敏试验结果表明,菌株20210120对恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、头孢氨苄、链霉素和庆大霉素7种药物敏感。结合农业农村部《水产养殖用药明白纸》文件中批准使用的药物目录,建议选用恩诺沙星对双棘黄姑鱼托鲁尼发光杆菌进行防治。【结论】托鲁尼发光杆菌是引起广西北海双棘黄姑鱼发病死亡的病原菌,实际生产中可考虑将恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、头孢氨苄、链霉素和庆大霉素7种药物(尤其是恩诺沙星)作为托鲁尼发光杆菌引起双棘黄姑鱼相关疾病的防治用药。

家庭参与型护理模式对早产儿生存质量的影响

目的探讨家庭参与型护理模式在早产儿护理中的应用价值。方法选择2015年1月至2016年2月符合入选标准的早产儿162例,按护理方法的不同分为观察组和对照组。观察组(早产儿81例,看护人145名),实施常规护理+家庭参与型护理;另81例早产儿(看护人140名)作为对照组,实施常规护理。患儿18月龄时进行随访,比较2组生长发育情况、婴幼儿智力行为发育贝利测定(BSID)、看护人育儿知识和技能考核和心理状况自评。结果患儿18月龄时,观察组日均体质量增长高于对照组[(27.38±2.76)g·d-1比(18.97±2.55)g·d-1,t=5.730、P=0.000];观察组MDI评分高于对照组[(94.97±4.55)分比(87.33±6.18)分,t=2.138、P=0.046];观察组PDI评分高于对照组[(87.35±5.97)分比(79.69±7.03)分,t=2.258、P=0.042]。观察组看护人育儿知识和技能得分高于对照组[(86.7±12.4)分比(63.7±9.3)分,t=7.982、P=0.013];观察组看护人心理状况自评分高于对照组[(24.24±3.25)分比(20.17±3.34)分,t=3.799、P=0.018]。结论家庭参与型护理模式可提高早产儿生存质量、促进其智力发育,也有利于患儿看护人自信心和积极情绪的形成。

三维倾斜摄影在煤矿开采中的研究及应用

随着无人机技术、机载定位技术、图像处理技术的快速发展,新兴现代化测量技术已广泛地应用于矿山监测和大比例尺地形图测量中。本文以倾斜摄影测量技术为研究对象,阐述了无人机倾斜摄影测量的发展现状,研究了运用Smart3D Capture进行快速三维建模的技术路线和注意事项,分析了其中存在的问题并给出了建议。通过实践发现,倾斜摄影快速三维建模技术可以为矿山环境监测、煤层自燃、灭火工程中提供高效、敏捷的数据支撑与服务,促进了精细三维数据获取能力和处理软件的市场的繁荣。

三种渔肥对池塘水质和浮游生物的影响

为优选出安全、高效的渔肥,试验研究了有机肥、生物肥和化肥三种渔肥对池塘水质和浮游生物的影响。结果表明:与有机肥和化肥比,生物肥能稳定水体pH值,明显增加水体溶氧,显著降解水体总无机氮(TIN)的含量(P<0.05);三种渔肥都能使水体中浮游生物的生物量增加,生物肥优于有机肥优于化肥,但之间差异不显著(P>0.05);有机肥组和化肥组水体中浮游植物的优势种类没有发生变化,还是以蓝藻、绿藻和隐藻为主;而生物肥组水体中的隐藻和硅藻所占的比例增加,隐藻占绝对优势,浮游植物的种类以隐藻、绿藻和蓝藻为主,有效地降低了蓝藻的比例;三种渔肥浮游动物种类的变化不明显。

Investigation of Calcium Sulfide Regeneration with Steam

Harmless treatment of CaS from coal gas desusulfurization and other industries is of very importance for the environmental protection. In this paper, the experimental investigation of calcium sulfide regeneration with steam at atmospheric pressure was carded out using TGA, fixed bed reactor and SEM-EDX analysis. The results show that the reaction mechanism of CaS with steam varies with temperature. The reaction occurs obviously at the temperature above 630℃ and the dominant products include CaSO4 （or CaSO3） and H2S, as the temperature is over 850℃, the primary products become CaO, SO2 and H2S. The CaS regeneration reaction will strongly depend on the temperature and the data over 900℃ can be fitted by the Shrinking-Core Model （SCM）.

针刺小鼠安全刺激量探析

小鼠实验是研究针刺作用机制的主要方式,文章从针刺小鼠安全刺激量入手,探讨针刺过程中如何保障小鼠的生命安全。总结分析了针具、选穴、针刺量学参数、得气等与安全刺激量之间的关系。探讨量学研究的主流观点及对实验的指导意义,强调开展针刺小鼠安全刺激量研究的必要性,减少实验动物无谓的牺牲,科学、合理、人道地使用实验动物。

尼罗罗非鱼PKCθ蛋白和Spartin蛋白的原核表达、抗体制备及其组织表达

为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)蛋白激酶C theta(PKCθ)和Spartin的蛋白表达情况,本实验在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达和提纯了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的重组蛋白,并利用日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)制备了相应的多克隆抗体。用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性,并检测其在罗非鱼肝、脾、肠和肌肉组织中的表达情况。结果表明,实验成功构建了原核表达载体p ET-B2m-PKCθ和pET-B2m-Spartin,实现了重组蛋白的原核表达和纯化。PKCθ重组蛋白主要存在于包涵体中,分子量约为56 ku;Spartin重组蛋白分子量约为30 ku,以包涵体蛋白的形式存在。获得的多克隆抗体效价均高达1︰512 000,Western Blot检测结果表明,制备的抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin多种异构体;PKCθ蛋白在罗非鱼肝、脾、肠与肌肉组织中均有表达;Spartin蛋白在罗非鱼的肝、脾和肠组织中不表达,在肌肉组织中表达。研究表明,尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,获得了高效价的多克隆抗体,并明确了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin在不同组织中的表达情况,为进一步研究尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的功能及其作用机制奠定了基础。