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变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定 被引量:4
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作者 王隆柏 陈秋勇 +3 位作者 吴学敏 陈如敬 车勇良 周伦江 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期3083-3089,共7页
【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过... 【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白。通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性。【结果】扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%。将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%。以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体。【结论】通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) M基因 N基因 双基因 融合蛋白
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猪圆环病毒3型去核定位信号的Cap蛋白原核表达 被引量:7
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作者 陈如敬 吴学敏 +4 位作者 陈秋勇 严山 车勇良 王晨燕 周伦江 《动物医学进展》 北大核心 2020年第11期24-28,共5页
为探讨猪圆环病毒3型(PCV3)去核定位信号结构蛋白(Cap)的生物学功能及其在血清学检测中的作用,应用Oligo 7.0软件设计特异性引物序列,采用PCR方法从PCV3福建株阳性核酸中扩增获得其去核定位信号的Cap基因片段。将目的片段克隆到原核表... 为探讨猪圆环病毒3型(PCV3)去核定位信号结构蛋白(Cap)的生物学功能及其在血清学检测中的作用,应用Oligo 7.0软件设计特异性引物序列,采用PCR方法从PCV3福建株阳性核酸中扩增获得其去核定位信号的Cap基因片段。将目的片段克隆到原核表达载体pET28a(+)上获得阳性重组表达质粒pET28a-Cap,进行原核表达条件优化。经SDS-PAGE分析其最优表达条件为IPTG浓度为0.4 mmol/L、37℃诱导表达4 h,目的蛋白大小约为25 ku。表达的去核定位信号Cap蛋白经Western blot和ELISA分析,具有良好的生物学活性。研究结果为开展PCV3去核定位信号基因功能研究和储备血清学诊断试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 去核定位信号 结构蛋白 原核表达
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多黏菌素耐药基因mcr-1重组酶介导扩增方法的建立及应用 被引量:6
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作者 车勇良 陈秋勇 +4 位作者 陈如敬 吴学敏 王隆柏 刘玉涛 周伦江 《动物医学进展》 北大核心 2022年第8期46-49,共4页
根据多黏菌素耐药基因mcr-1的保守序列,设计合成一对重组酶介导扩增方法(RAA)特异性引物和一条FAM标记的荧光探针,优化扩增条件,建立了检测多黏菌素耐药基因mcr-1的RAA方法,验证其特异性和敏感性,并应用于临床检测。结果显示,建立的RAA... 根据多黏菌素耐药基因mcr-1的保守序列,设计合成一对重组酶介导扩增方法(RAA)特异性引物和一条FAM标记的荧光探针,优化扩增条件,建立了检测多黏菌素耐药基因mcr-1的RAA方法,验证其特异性和敏感性,并应用于临床检测。结果显示,建立的RAA方法只需21 min就能出结果,能特异性地检测多黏菌素耐药基因mcr-1,最低能检测出10~2的mcr-1阳性质粒拷贝数,也可很好地检测出临床样品中的mcr-1基因。4株临床分离大肠埃希氏菌株样品,有2株mcr-1基因阳性,2株为mcr-1基因阴性。 展开更多
关键词 多黏菌素 耐药基因 mcr-1 重组酶介导扩增方法
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变异猪流行性腹泻病毒M和N融合双基因的原核表达及表达产物免疫原性分析 被引量:2
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作者 王隆柏 王晨燕 +4 位作者 吴学敏 陈秋勇 车勇良 陈如敬 周伦江 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1249-1255,共7页
旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组... 旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至E2-M片段,转化到Trans 1-T1感受态细胞中,构建出pE2-M-N融合双基因质粒并转化Transetta(DE3),表达出相应的融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达情况。将纯化的M-N融合蛋白皮下接种BLAB/c小鼠,通过ELISA方法检测融合蛋白的免疫原性。结果表明:扩增出M和N基因,成功构建了pE2-M质粒,并将E2-M基因与N基因进行有效连接,构建出pE2-M-N融合双基因质粒,表达出了具有免疫原性的M-N融合蛋白,该蛋白能够诱导小鼠产生相应的特异性抗体。变异PEDV的pE2-M-N双基因融合质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术和免疫学等研究,奠定良好基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 PEDV M基因 N基因 双基因表达
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新型伪狂犬病病毒gB、gC蛋白串联表达及免疫活性分析 被引量:1
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作者 吴学敏 陈如敬 +5 位作者 陈秋勇 王隆柏 车勇良 严山 刘玉涛 周伦江 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期60-65,共6页
为研究新型PRV毒株主要抗原表位,并获得具有良好免疫原性的表位串联体,本研究通过扩增新型PRV FJ-2012株gB、gC蛋白基因片段,经密码子优化后构建串联表达序列,并链接原核表达载体pET-28a(+)克隆位点,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPT... 为研究新型PRV毒株主要抗原表位,并获得具有良好免疫原性的表位串联体,本研究通过扩增新型PRV FJ-2012株gB、gC蛋白基因片段,经密码子优化后构建串联表达序列,并链接原核表达载体pET-28a(+)克隆位点,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达获得gBC串联蛋白,并用间接ELISA法测定其兔多克隆抗体血清效价,通过Western blot、间接免疫荧光试验评价其免疫活性。结果表明成功构建了PRV-gBC串联蛋白表达体系,并获得新型PRV FJ-2012株gBC串联重组蛋白;ELISA检测其克隆抗体血清效价可以达到1∶6400,Western blot试验显示gBC串联蛋白与多抗血清能产生特异性反应,免疫荧光试验说明克隆抗体血清能与FJ-2012株抗原发生免疫反应。本研究串联表达的新型PRV FJ-2012株gB、gC跨膜区域蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究新型PRV优势抗原表位奠定了基础。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 gB蛋白 gC蛋白 串联表达 免疫活性
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一株猪链球菌的分离鉴定及其防治 被引量:1
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作者 王隆柏 郑丽英 +4 位作者 陈秋勇 吴学敏 陈如敬 车勇良 周伦江 《福建农业科技》 CAS 2021年第7期26-29,共4页
从福建某发病规模猪场保育猪的肺脏中分离到1株细菌,根据分离细菌的形态观察、生化试验、培养特性、PCR鉴定和动物攻毒试验,结合发病猪的临床症状和病理变化,表明该分离菌为偏向厌氧型链球菌,具有在血平板上培养良好且能致小白鼠发病死... 从福建某发病规模猪场保育猪的肺脏中分离到1株细菌,根据分离细菌的形态观察、生化试验、培养特性、PCR鉴定和动物攻毒试验,结合发病猪的临床症状和病理变化,表明该分离菌为偏向厌氧型链球菌,具有在血平板上培养良好且能致小白鼠发病死亡等特性。药敏试验表明:分离链球菌对万古霉素、亚胺培南、利奈唑胺和菌必治高度敏感,对阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻肟、呋喃妥因和替加环素中度敏感,对卡多西环素、多粘菌素、青霉素、链霉素、恩诺沙星等药物不敏感。猪场根据药敏结果,采取紧急防治措施,疫情5 d后得到有效控制。 展开更多
关键词 猪链球菌 分离鉴定 防治
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2,2,2-三氟-1-苯基-1-胺类化合物的合成 被引量:1
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作者 王泽华 赵诗音 +1 位作者 陈茹箐 陈定奔 《当代化工》 CAS 2020年第2期305-308,共4页
以卤代苯甲醛与叔丁基亚磺酰胺为原料,在钛酸异丙酯催化下合成中间体1(E)-N-(4-卤苄基)-2-甲基丙烷-2-亚砜酰胺(1a-1b);然后在TBAF引发下,与TMSCF3反应得到中间体2a-2b N-(1-(4-卤苯基)-2,2,2-三氟乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺;最后经... 以卤代苯甲醛与叔丁基亚磺酰胺为原料,在钛酸异丙酯催化下合成中间体1(E)-N-(4-卤苄基)-2-甲基丙烷-2-亚砜酰胺(1a-1b);然后在TBAF引发下,与TMSCF3反应得到中间体2a-2b N-(1-(4-卤苯基)-2,2,2-三氟乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺;最后经酸水解得到2,2,2-三氟-1-苯基-1-胺类化合物(3a-3b)。所有化合物结构经红外、核磁、质谱对其进行表征。 展开更多
关键词 2 2 2-三氟-1-苯基-1-胺 叔丁基亚磺酰胺 三氟甲基三甲基硅烷 合成
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Effect of Eliminated the Breeding Pigs with Unqualified CSFV Antibody on Sows' Reproductive Performance and Pigs' Growth Performance
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作者 XIU Jin-sheng WU Shun-yi +5 位作者 ZHOU Lun-jiang YE Yao-hui YU Dao-jin chen ru-jing WANGLong-bai ZHANG Xin-liang 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2011年第5期728-732,共5页
[Objective] The aim was to explore the effect of eliminated the breeding pigs with unqualified CSFV antibody on sow's reproductive performance and pig's growth performance so as to provide a scientific basis f... [Objective] The aim was to explore the effect of eliminated the breeding pigs with unqualified CSFV antibody on sow's reproductive performance and pig's growth performance so as to provide a scientific basis for the eliminating of the breeding pigs with unqualified CSFV antibody in large-scale pig farms.[Method] Serum samples from three scale pig farms were collected and tested with HerdChek CSFV-ELISA kit,then provided a certain scientific basis for scale pig farm to eliminate the unqualified(antibody blocking rate<50%)breeders after booster immunization.[Result ] After eliminating the breeding pigs with unqualified CSFV antibody,the average litter number of piglet in three pig farms(A,B,C)were increased by 0.29(P<0.05),0.40(P<0.01),0.39(P<0.01)respectively;the average number of survival piglets were increased by 0.54(P<0.01),0.35(P<0.01),0.62(P<0.01)respectively;the average litter number of weaned piglets were increased by 0.65(P<0.01),0.71(P<0.01),0.81(P<0.01)respectively.The difference in weight gain of piglet at 30-60 d of age was extremely significant(P<0.01),but inconspicuousness for the swine pregnancy rate,the survival rate of weaned piglet and piglet at 30-60 d of age.[Conclusion] The eliminating the breeding pigs with unqualified CSFV antibody can significantly improve the performance of breeder and piglets. 展开更多
关键词 Classical swine fever Eliminate Reproductive performance Growth performance
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