黄龙病菌侵染晚锦橙叶脉和根早期病原蛋白组学的比较分析

【目的】黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,由于黄龙病病原菌无法离体培养,其关键的致病机制仍不清楚。为此,通过蛋白组学分析探究黄龙病菌侵染晚锦橙早期时病原蛋白的表达情况。【方法】利用叶圆片嫁接技术对晚锦橙(Citrus sinensis Osbeck)进行嫁接传毒,在传毒2个月时,对感病后的根和叶脉组织进行蛋白组测序,以黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)基因组为参考,对测序结果进行注释,并以感病叶脉为对照,筛选病原菌差异表达蛋白,最后利用qRT-PCR对显著性差异表达蛋白质进行验证。【结果】共鉴定出38个病原蛋白,其中有6个显著性表达差异蛋白;GO功能注释揭示这些病原蛋白主要与核酸结合和物质转运活性相关;qRT-PCR结果显示,6个显著差异蛋白在根部组织中的表达水平显著高于叶片组织;其中ABC转运系统重要组成成分CLasMalE(ACT56611.1)转运蛋白基因的表达倍数高达595倍。【结论】在黄龙病菌侵染柑橘根和叶的早期,与病原菌物质运输和核酸代谢相关基因的表达差异明显,暗示其在黄龙病菌侵染寄主中起着重要作用,为黄龙病菌致病机制研究提供了基因资源和理论基础。

GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR_1和LRR_2);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系(8个株系)进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降(为野生型的23.12%—75.49%),其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。

柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

【目的】活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘(甜橙)CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员(CsRboh01—CsRboh07),其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点(PI)分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域(NADPHOx)、铁还原酶跨膜组件(Ferricreduct)、FAD结合结构域(FADbinding)和铁还原酶NAD结合结构域(NADbinding)4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。

柑橘SAR及其信号转导基因CsSABP2在黄龙病菌侵染中的响应特征

【背景】柑橘系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)在柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)过程中起着重要作用。水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)信号互换是激活植物SAR的关键信号转导途径,但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚。【目的】以柑橘HLB不同耐病品种为材料,研究柑橘SAR及其信号转导的关键酶基因CsSABP2(salicylic acid binding protein 2)在HLB病原菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(CLas)侵染中的响应特征,了解柑橘SAR及CsSABP2响应CLas侵染的作用。【方法】从SAR Marker基因CsPR1、CsPR2、CsPR5表达、活性氧H_(2)O_(2)水平和淀粉含量变化等方面分析CLas侵染、外施SA和MeSA调控柑橘SAR的特征。进一步,基于易感HLB锦橙(Citrus sinensis)和耐HLB酸柚(C.grandis)感染CLas转录组测序比较分析,筛选和克隆响应CLas侵染的CsSABP2差异表达基因;生物信息学分析预测差异基因的生物学功能;qRT-PCR分析差异表达基因在锦橙、酸柚和耐HLB马蜂柑(C.hystrix)中响应CLas感染的表达变化;以锦橙叶片为试材分析差异表达基因响应外源SA和MeSA诱导的表达特征。【结果】SAR Marker基因响应CLas表达分析表明,CsPR1、CsPR2和CsPR5均正向响应CLas侵染上调表达,CsPR2和CsPR5在酸柚和马蜂柑中表达水平高于锦橙,特别是叶肉中两个基因的表达水平均显著高于锦橙;相反,CsPR1在叶脉中上调表达水平明显高于叶肉,且在锦橙叶脉中表达水平显著高于酸柚和马蜂柑叶脉中。离体模拟SA和MeSA调控柑橘SAR反应显示,与SA处理相比,MeSA处理明显诱导CsPR1、CsPR2和CsPR5上调表达,同时非处理部位基因(特别是CsPR5)表达水平也明显上调。H_(2)O_(2)检测结果表明,外源MeSA诱导非处理部位H_(2)O_(2)积累显著强于SA。同时,通过对外施MeSA、SA的感病叶片进行连续5周的淀粉含量检测,发现MeSA能明显减少感病叶片中淀粉的积累。进一步转录组数据和生物信息学分析表明,4个SAR关键调控基因CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-3、CsSABP2-4显著响应CLas侵染而差异表达,且编码蛋白质均含SABP2水解活性必需的保守结构域。qRT-PCR结果表明,CsSABP2-1、CsSABP2-4在耐病品种酸柚和马蜂柑中受CLas诱导高水平表达且在叶脉中的表达水平高于叶肉;CsSABP2-2和CsSABP2-3表达水平变化不明显。激素诱导结果显示,CsSABP2主要响应MeSA的诱导表达,MeSA显著诱导CsSABP2-2高水平表达(>10倍),且显著下调CsSABP2-1和CsSABP2-4的表达(下调至0 h表达量的15%—55%)。【结论】耐病品种酸柚和马蜂柑SAR响应CLas的反应明显强于易感病品种锦橙,且MeSA在介导柑橘SAR抗病反应中起正向调控作用。SA与MeSA信号转导的关键酶基因CsSABP2-1和CsSABP2-4在柑橘SAR响应CLas侵染中起着重要作用,其高水平表达与柑橘HLB抗性紧密相关;而且CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-4在调控SAR应答柑橘CLas侵染中可能起着关键的协同作用。

转CiNPR4基因柑橘抗溃疡病的机制解析

【目的】病程相关基因非表达子1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1)是水杨酸(salicylic acid,SA)介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子,在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。研究耐黄龙病的‘Jackson’葡萄柚(Citrus paradisi)中的NPR1-like基因CiNPR4对柑橘溃疡病的抗性,解析过表达CiNPR4的转基因晚锦橙(C.sinensis)抗柑橘溃疡病的机理。【方法】选取黄龙病抗性增强的CiNPR4转基因柑橘,采取完全成熟的叶片利用针刺法进行柑橘溃疡病的离体抗性评价分析;在此基础上,对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株利用针刺法离体接种溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc),统计接种Xcc后0、1、3、5、7和9 d的细菌数量;利用注射法对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片接种Xcc,接种后0、3和5 d收集接种部位的叶片,测定叶片中SA和茉莉酸(jasmonic acid,JA)含量;同时,收集接种Xcc后0、3和5 d接种部位的叶片,利用实时荧光定量PCR分析SA和JA分别介导的防御反应相关基因CsPR1和CsPDF1.2在Xcc诱导下表达水平的变化;根据CiNPR4蛋白与TGA转录因子相互作用网络预测CiNPR4互作蛋白为Ciclev10005080m和Ciclev10001081m,以甜橙为参考基因组,将这两个基因在https://www.citrusgenomedb.org/网站上进行blastx分析,预测CiNPR4在甜橙基因组中互作的候选蛋白,克隆CiNPR4和候选蛋白基因的cDNA,利用同源重组法分别构建诱饵载体和猎物载体,并将诱饵质粒和猎物质粒共转入酵母菌株Y2HGold中,进行点对点酵母双杂交分析。【结果】CiNPR4的超量表达减轻了转基因柑橘叶片上溃疡病的症状,柑橘溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片上Xcc的生长比较缓慢,在接种Xcc后9 d,转基因植株Xcc数量显著低于野生型(wild type,WT)晚锦橙;Xcc诱导0 d,溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株含有与WT植株无差异的SA含量,随着Xcc诱导时间的延长,CiNPR4转基因植株中SA的含量显著增加;而Xcc处理0 d时,WT植株含有显著高于CiNPR4转基因植株的JA含量,随后,JA含量在CiNPR4转基因植株中逐步上升,Xcc处理5 d时,达到显著高于WT植株的水平;而WT植株在整个处理期间SA和JA的含量基本保持不变;溃疡病抗性增强的转基因植株受Xcc诱导3 d时CsPR1的表达水平迅速上升,达到与WT植株差异显著的水平,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升;WT植株受Xcc诱导后CsPR1的表达水平没有发生显著变化,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升,且显著高于CiNPR4转基因植株中CsPDF1.2的表达水平;酵母双杂交分析证实,CiNPR4与甜橙基因组中的CsTGA2转录因子互作。【结论】CiNPR4与CsTGA2转录因子互作,通过促进SA而抑制JA介导的防御反应,调控转基因柑橘对溃疡病的抗性。

csi-miR399响应柑橘溃疡病菌侵染的表达模式及其抗病性分析

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)侵染的表达模式,筛选其靶基因,进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性,为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘(Citrus microcarpa)和感病品种纽荷尔脐橙(Citrus sinensis)为试材,通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化,明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式;利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因,并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化;克隆csi-miR399前体基因序列,通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399,根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬(Citrus limon),通过qPCR分析csi-miR399表达量;进而采用离体叶片针刺法接种Xcc,观察发病症状,统计病情指数,分析csi-miR399过表达对Xcc抗性的影响。【结果】接种Xcc后,csi-miR399在抗病品种四季橘中的表达呈现先下降再上升的趋势,而在感病品种纽荷尔脐橙中的表达呈持续下降趋势。接种Xcc 5 d时,csi-miR399在四季橘与纽荷尔脐橙中的表达量分别是健康对照的4.64倍和7.61%,初步表明csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性相关。从13个预测靶基因中筛选鉴定了csi-miR399的3个靶基因Cs2g06030、Cs7g03830、Cs8g18800,分别编码泛素偶联酶PHO2、未知蛋白和漆酶。利用构建的病毒表达载体pCLBV202-MIR399获得过表达csi-miR399的柠檬植株(Y37、Y41和Y57),与空载体对照pCLBV202接种植株(L35)相比,Y37、Y41和Y57中csi-miR399表达量显著增加,接种Xcc后的溃疡病病斑面积显著减小,病情指数显著降低(P<0.01),表明csi-miR399过表达显著提高了柠檬的溃疡病抗性。【结论】csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性密切相关,过表达csi-miR399显著提高柑橘对溃疡病的抗性,可应用于柑橘抗溃疡病的分子育种。

紫杉醇和多柔比星处理改变小鼠乳腺癌免疫微环境并抑制肿瘤细胞生长

目的探讨紫杉醇和多柔比星对小鼠乳腺癌免疫微环境的影响。方法用肿瘤药物应答相关基因表达谱及耐药特征分析数据库CTR-DB分析化疗药对乳腺癌免疫微环境的影响。用4T1细胞原位注射建立小鼠乳腺癌模型,分别用多柔比星和紫杉醇处理。测定小鼠肿瘤大小并绘制生长曲线。采用流式细胞术检测乳腺癌免疫细胞的数量,免疫组织化学染色法检测小鼠乳腺癌组织中乳腺癌抗原KI-67(ki67)、S100钙结合蛋白A9(S100A9)和基质金属蛋白酶9(MMP9)。流式细胞术检测紫杉醇组和多柔比星组中4T1细胞的周期。结果CTR_Microarray_75结果表明药物敏感的乳腺癌中免疫分值、细胞毒性淋巴细胞、B细胞谱系、CD8^(+)T细胞、树突状细胞(DC)、单核细胞谱系以及自然杀伤(NK)细胞等指标均比药物不敏感的乳腺癌高。通过乳腺癌小鼠生长曲线分析,发现紫杉醇和多柔比星均能显著抑制肿瘤体积的增长,而且紫杉醇的肿瘤抑制作用强于多柔比星。通过流式细胞术检测,我们发现紫杉醇和多柔比星均能抑制乳腺癌细胞ki67的表达,并使停滞在G2/M期的乳腺癌细胞增多,其中紫杉醇的作用明显强于多柔比星。多柔比星和紫杉醇均能导致CD45^(+)免疫细胞的增加和中性粒细胞的减少;而且紫杉醇诱导CD3^(+)CD4^(+)辅助性T细胞、CD3^(+)CD8^(+)细胞毒性T细胞、CD45^(+)CD19^(+)B细胞数量增加,而多柔比星诱导CD4^(+)CD25+调节性T细胞(Treg)增加。免疫组织化学染色结果表明紫杉醇对S100A9的抑制作用更强,而多柔比星对MMP9的抑制作用更强。结论紫杉醇和多柔比星可以有效抑制肿瘤细胞的生长,并调控不同的细胞浸润模式和不同细胞基质外成分,改变三阳性乳腺癌(TNBC)的免疫微环境。

茉莉酸在植物抗逆性中的研究进展

茉莉酸(jasmonic acid,JA)是一种植物内源合成的脂类激素,在植物响应胁迫的调控中发挥着重要作用。本文概括了JA的生物合成与代谢途径及其调控机制;总结了JA信号的传导通路;系统归纳了JA在植物响应生物和非生物胁迫应答中的作用机制和调控网络,重点关注了最新的研究进展。此外,本文梳理了JA与其他植物激素在植物抗逆性调节过程中的信号交流。最后讨论了JA信号通路介导的植物抗逆性研究中亟待解决的问题,并展望了新的分子生物学技术在调控JA信号通路增强作物抗性中的应用前景,以期为植物的抗逆性研究和改良提供参考。

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。

早熟脐橙新品种‘青秋’

脐橙新品种‘青秋’系由‘眉红’脐橙早熟变异株选育而成。果实卵圆形或长椭圆形,果形指数1.18,单果质量270 g,果皮橙红色,果肉脆甜化渣,风味浓郁,可溶性固形物含量12.9%,可滴定酸0.67%,维生素C 0.59 mg·mL^-1,可食率70.8%。自然坐果率高,丰产性强,嫁接苗定植第3年平均株产9.9 kg,高换树第3年平均株产23.4 kg。在重庆地区果实10月中下旬成熟。

植物胼胝质合成酶研究进展

胼胝质是一种β-1,3–葡萄糖聚合物,植物在生长发育和受到生物、非生物胁迫过程中均会有胼胝质沉积。胼胝质合成酶又称β-1,3–葡聚糖合成酶类似物,通常以多亚基复合物形式控制胼胝质的合成。本文中对胼胝质合成酶的分离鉴定过程进行了梳理,对胼胝质合成酶复合物的亚基及其作用进行了描述,重点总结了转录因子、植物生长调节剂等对胼胝质合成酶基因表达的调控作用,并对胼胝质合成酶在花粉发育和韧皮部运输过程中的作用,对机械损伤、磷酸盐、金属离子等非生物胁迫,以及虫害、细菌和真菌等生物胁迫的应答反应进行了归纳;最后对胼胝质合成酶的研究方向提出展望,以期为解析胼胝质合成酶的调控机制提供参考,也为植物(特别是园艺植物)抗性基因的挖掘提供借鉴。

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期(2个月)锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础,筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因,从中选3个差异表达水平较高的基因克隆,分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征;烟草亚细胞定位结果表明,Cs NAC68定位在细胞核,Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照,Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染,显著上调表达,Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染,显著上调表达;Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、JA、ABA、ETH诱导的表达特征,结果表明,3个基因可能参与ABA的信号转导途径,Cs NAC68可能参与SA和JA的信号转导途径,而Cs NAC78可能参与ETH的信号转导途径。

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶(CsADH1)基因进行克隆测序分析,结果表明,CsADH1的CDS序列长为1143bp,编码380个氨基酸。蛋白质结构预测显示,CsADH1含有乙醇脱氢酶Gro ES(ADH_N)和ADH_zinc_N保守结构域。进化树分析显示,CsADH1蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的ADH蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,CsADH1蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料,q PCR分析显示CsADH1在感病根和叶脉中均上调表达,且根中的表达水平是叶脉中的10倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明,Zn、水杨酸(SA)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)均显著诱导CsADH1上调表达,并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明,CsADH1可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。

过氧化氢酶基因CsKat01与柑橘溃疡病相关性分析

为了探究过氧化氢酶基因Cs Kat01在柑橘抵御溃疡病过程中的作用,对感病品种‘晚锦橙’和抗病品种‘四季橘’中Cs Kat01进行了生物信息和表达分析,并探究了溃疡病菌接种处理后两品种中CAT酶活性和H2O2含量的关系。克隆Cs Kat01的编码序列并对该基因及其编码蛋白进行结构和功能分析,发现Cs Kat01编码框全长为1482bp,共编码493个氨基酸残基,蛋白序列中含有典型的CAT结构域;通过启动子序列克隆和分析发现‘晚锦橙’和‘四季橘’核心启动子区域均含有水杨酸、茉莉酸和脱落酸的响应元件,但数量不同;利用q RT-PCR分析水杨酸、茉莉酸、脱落酸和柑橘溃疡病菌(Xcc)对Cs Kat01的诱导表达特性,发现Cs Kat01的高表达可能使柑橘相对更感病;结合Xcc诱导后植物组织中Cs Kat01酶活性和H2O2含量,综合分析Cs Kat01、CAT酶活、H2O2含量和柑橘对溃疡病抗性之间的关系,推测Cs Kat01基因可能通过调控CAT的酶活性,改变H2O2含量进而影响柑橘对溃疡病的抗性。

柚类种质资源表型多样性分析及综合评价

为了建立合理的柚类分类系统并为柚类育种提供参考,本研究以82份柚类种质资源为试材,采用变异系数、Shannon-Weaver多样性指数、方差、相关性、主成分、聚类、回归分析等对其26个表型性状进行多样性分析、差异分析及综合评价。结果表明:这82个品种的26个性状的变异系数为0.26%。其中翼叶面积和果心面积变异较大,其他性状遗传特性较稳定;单果重、果横径、果形指数、果皮厚、囊瓣数、种子数、果心长和宽、叶片长和宽、叶片面积、花瓣宽、花柄长等性状等级分布均匀,翼叶面积、花瓣数、雄蕊长分级较少且分布不均;来源于中国大陆以外品种的果皮厚、叶柄长、翼叶长,明显优于长江流域和珠江流域来源的材料,但雌蕊长则相反;选育品种的叶片长、宽和面积显著大于遗传材料和地方品种;82个品种可聚为大翼叶大果型、大翼叶小果型,小翼叶大果型,小翼叶小果型4个类群;前7个主成分累计贡献率75.57%,包含了柚类表型性状的大部分信息;26个性状F平均值0.45,其中早暹柚得分最高为0.69,红肉琯溪蜜柚最低为0.24;囊瓣数、种子数等12个性状与F值极显著相关;回归方程筛选出单果重、囊瓣数等19个性状。本研究说明柚类种质资源具有较高的表型多样性,筛选出的19个性状可作为柚类综合评价指标,为柚类育种提供科学依据。

柑橘抗溃疡病转录因子CsAP2-09互作蛋白筛选与分析

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因CsAP2-09超表达植株为材料,利用GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)联合液相色谱串联质谱(LC–MS/MS)方法筛选并鉴定CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化GST-CsAP2-09作为诱饵蛋白,然后与CsAP2-09超表达植株叶片总蛋白孵育、洗脱后进行SDS-PAGE验证,最后进行LC–MS/MS鉴定。得到17个互作蛋白,将蛋白进行注释、GO分析、KEGG分析,发现其中5个可能与植物抗病相关(如过氧化氢酶Cs3g27280)。构建这17个蛋白的互作网络,其中14个蛋白的互作关系得到已有数据的支持。对CsAP2-09与互作蛋白的共表达分析发现CsAP2-09超表达引起了16个蛋白表达上调和1个蛋白表达下调。

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,Las)具有完整的Sec依赖型分泌系统,可分泌致病因子(效应子)作用于寄主靶标蛋白或基因,调控寄主的抗(感)病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因,本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70(CLIBASIA02470)。生物信息分析显示,SDE70蛋白全长132个氨基酸,N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示,该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示,SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现,耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉,相反,易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉;‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉,而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明,42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关;65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上;34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白(CsTRAPP、CsARF、CsRub1),其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程,暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗(感)病反应。

柑橘R2R3-MYB类转录因子CitMYB20的克隆与表达分析

为解析柑橘R2R3-MYB转录因子家族成员CitMYB20基因的分子生物学特征及受柑橘黄龙病病菌和溃疡病病菌的诱导表达情况。本研究同源克隆了不同柑橘品种中CitMYB20基因的开放阅读框序列,利用生物信息学方法预测其生物学功能并分析比较该基因在不同品种间的序列差异。在洋葱表皮细胞中瞬时表达观察CitMYB20的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术分析黄龙病病菌胁迫和溃疡病病菌胁迫时CitMYB20的表达量变化。研究结果显示柑橘CitMYB20基因在晚锦橙、酸柚、纽荷尔脐橙和四季橘中的相似度达到99.01%,高度保守。晚锦橙中该基因含有3个外显子和2个内含子,其开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸残基。CitMYB20蛋白的N端高度保守,具有两个R结构域,属于典型的R2R3类型的MYB转录因子家族的成员。洋葱表皮细胞亚细胞定位分析结果表明该基因定位于细胞核中。CitMYB20基因受黄龙病病菌胁迫时,在黄龙病敏感品种晚锦橙和耐性品种酸柚中均显著上调表达,其中在耐病品种酸柚中上调表达24倍,在感病品种晚锦橙中上调表达34倍;而在溃疡病病菌胁迫时,CitMYB20基因仅在溃疡病抗性品种四季橘中显著差异表达,感病后上调表达3倍。推测该基因对黄龙病和溃疡病的应答差异可能是因为不同的调控机制造成的,构建CitMYB20基因过表达载体拟对不同病原的应答情况进行深入研究。

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。