基于多维TCSPC技术的心肌细胞Ca^(2+)动力学研究

采用Fluo-4和Ca-orange标记细胞质及线粒体中的Ca2+,通过多维时间相关单光子计数技术研究心肌收缩时Ca2+动力学.结果表明,在心肌收缩后10～110 ms的Fluo-4荧光强度明显强于心肌收缩后1 s的荧光强度,归一化光谱和细胞自发荧光一致;静止状态下,成分荧光寿命时间和相关振幅在峰值540nm波长处τ1=(0.42±0.01)ns(73±5)%,τ2=(2.74±0.67)ns(25±5)%,平均荧光衰减时间τmean=0.83 ns;Ca-orange荧光峰值560 nm,加入线粒体呼吸链阻断剂Rotenone后,10～110 ms的Ca-orange荧光强度显著降低.综合评估了心肌细胞收缩时细胞质和线粒体中荧光团的光谱及时间分辨荧光特性,该方法可为心肌收缩过程提供满意的光谱和时间分辨荧光记录,有助于理解细胞综合行为.

光谱分辨的NAD(P)H荧光寿命光谱学对心肌氧化代谢的评估

应用光谱分辨的NAD(P)H荧光寿命光谱学研究心肌细胞线粒体氧化代谢状态,监测病理情况下线粒体功能改变的早期信号。研究将NAD(P)H作为无创荧光探针,用光谱分辨的时间相关单光子计数记录375nm紫外光激发的心肌自发荧光(AF)光谱和寿命,测试影响NADH生产或线粒体呼吸时AF动态衰减。结果显示:在420～560nm光谱区域,需用至少3个荧光寿命池0.4～0.7ns、1.2～1.9ns和8.0～13.0ns描述细胞AF。酮体增加NADH水平,提高AF强度,但不改变荧光寿命。线粒体呼吸阻断剂Rotenone,显著增加AF强度,缩短平均荧光寿命。氧化磷酸化解偶联剂(DNP),显著降低AF强度,在520nm处增宽荧光光谱,延长平均荧光寿命。这些结果和NADH荧光动力学离体实验(invitro)有可比性。研究证实光谱分辨的荧光寿命技术测定心肌NAD(P)H荧光有很好的重复性,增加了心肌氧化代谢或线粒体功能障碍在细胞水平上的知识,为临床诊断和治疗线粒体功能障碍开拓了新视野。

应用心肌自发荧光评估存活心肌线粒体氧化代谢状态

目的：应用心肌自发荧光（AF）研究心肌线粒体氧化代谢状态，监测线粒体功能改变的早期信号。方法：烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸ENAD（P）HI作为荧光探针，用光谱分辨的时间相关单光子计数（TCSPC）记录375nm紫外激光激发的心肌AF光谱和荧光寿命，测试影响线粒体呼吸时AF动态衰减。结果：在420～560nm光谱区域，至少需用3个荧光寿命池0．4～0．7ns，1．2～1．9ns和8．0～13．0ns描述细胞AF。线粒体呼吸阻断剂鱼藤酮可显著增加AF强度，缩短平均荧光寿命。氧化磷酸化解偶联剂二硝基酚可显著降低AF强度，在520nm处增宽荧光光谱，延长平均荧光寿命。这些结果和NADH荧光动力学离体实验（invitro）有可比性。结论：光谱分辨的荧光寿命技术测定心肌NAD（P）H荧光有很好的重复性，在细胞水平上增加了心肌氧化代谢或线粒体功能障碍的知识，为临床诊断和治疗线粒体功能障碍开拓了新视野。