甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌耐链霉素rpsL基因突变位点的检测

目的 通过检测甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌耐链霉素rpsL基因位点,掌握该地区鼠疫菌对链霉素的敏感性,以期为今后该地区鼠疫的治疗及临床用药提供参考依据。方法 根据鼠疫菌rpsL基因序列及我国发现的耐链霉素菌株(S19960127)突变位点分别设计非突变菌株FAM(128∶A)和突变菌株VIC(128∶G)两种MGB探针,通过TaqMan-MGB探针法对1962—1991年分离自甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地的49株代表性鼠疫菌进行耐链霉素rpsL基因突变位点检测。结果 被试菌株对应检测rpsL(128∶A),49株FAM染料RFU峰值均为阳性,其RFU峰值>2 000,阴性<200;对应检测rpsL(128∶G)未检测到VIC染料RFU峰值阳性菌株,RFU峰值均<200,阳性对照>1 000,该疫源地分离的鼠疫菌未发现耐链霉素菌株。结论 甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地49株鼠疫菌对链霉素均敏感。TaqMan-MGB探针荧光定量PCR体系具有较高灵敏性、特异性,可应用于鼠疫菌耐药性监测。

青海省海西州鼠疫自然疫源地分离鼠疫菌株CRISPR基因分型研究

目的利用DNA规律聚集簇间隔短回文重复序列(Clustered regularlyinter-spaced short palindromic repeats CRISPR)分型方法,全面探索海西地区分离鼠疫菌株是否存在新的基因型,为鼠疫菌溯源鉴定及流行病学分析提供理论依据。方法分离培养海西地区1961-2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的50株鼠疫菌后提取其DNA,利用PCR技术,对鼠疫菌CRISPR分型中的YPa、YPb、YPc 3个位点进行扩增,测定其扩增产物核酸序列并进行分析,将测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和NCBI数据库进行比对,找出新的CRISPR spacer阵列,基因型别,分析其进化关系,最终确定青海省海西州喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地鼠疫菌株的CRISPR基因库。结果50株鼠疫菌在3个CRISPR位点上共有24种spacer,其中YPa位点上有13种、YPb位点8种、YPc位点3种,b51是新发现的spacer。50株鼠疫菌可被分为16个基因型,共归为6大CRISPR类群。Ca35′是该地区主要流行类群;Ca7是流行最为广泛的类群;Cb4和Cb4′仅存在于格尔木唐古拉地区。结论青海省海西州地区鼠疫菌种群结构复杂,Ca35′、Ca7、Cb4′是流行最普遍的种群,G26-a1′型、G22型、G9型、G26-a1′a4-为主要基因型,呈现显著的地区分布特征,今后可以利用CRISPR基因分型技术加强该地区鼠疫溯源检测和防控工作。

青海地区喜马拉雅旱獭疫源地鼠疫菌基因组时空演变及其生态适应分析

目的探索青海地区喜马拉雅旱獭疫源地鼠疫菌基因组时空演变及其影响因素。方法采用判断抽样选取青海地区喜马拉雅旱獭疫源地自然分离到的鼠疫菌556株,对其基因组型DFR数据进行分析,采用鼠疫菌基因组分型和空间流行病学方法,绘制鼠疫菌基因组DFR时空演变专题地图,综合分析鼠疫菌基因组时空演变特征及其趋势,探索鼠疫菌基因组时空演变影响因素。结果青海地区喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌DFR分型存在着明显的时空差异。在空间尺度上,5型和8型分布广泛,其中5型主要分布在玉树和唐古拉地区,8型主要分布在海南、海西和海北等地;32型仅存在唐古拉地区,44型则分布在海北的祁连、门源2个地区。在时间尺度上,各地分离到的鼠疫菌基因组DFR型别均有不同程度的种群替代,这一特点在玉树地区表象尤为明显。结论鼠疫菌基因组型时空分布及其演变受鼠疫疫源地所在的生态环境的综合影响,而气候因素是其中的一个重要环节,这将为基于生态流行病学和基因组流行病学的现代鼠疫防治和学科建设提供参考依据。

海南州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐消毒剂及耐药相关基因的检测

目的了解海南州鼠疫疫源地分离的鼠疫菌耐消毒剂及耐药相关基因携带状况,以指导该疫源地的鼠疫防治。方法根据美国国立生物信息中心(NCBI)公布的耐消毒剂qacEdelta1-sul1基因、耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、shv、ctx-m基因及耐磺胺类药物sull、sul2、sul3基因序列,分别在每个基因上设计一对引物,逐一对87株分离自青海省海南州鼠疫自然疫源地的鼠疫菌的DNA进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳,用凝胶成像系统拍照后读取结果。结果 PCR扩增结果显示,阴性对照和阳性对照均成立,87株鼠疫菌的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,均未在预计的DNA标志物(Mr)处出现条带,其PCR扩增结果均为阴性。1954-2016年期间从青海省海南州共和县、贵德县、同德县、兴海县、贵南县分离的鼠疫菌株中尚未发现有耐链霉素、磺胺类药、β-内酰胺类抗菌药物及耐消毒剂等相关基因的菌株。结论海南州鼠疫疫源地分离的87株鼠疫菌不具有耐消毒剂及耐药相关基因的特征。

青海高原藏系绵羊鼠疫菌系统发育关系和流行特征的研究

目的 对青海高原藏系绵羊引发的人间鼠疫疫情流行病学和相关鼠疫菌遗传特征进行研究,为制定出适合青海省藏系绵羊鼠疫防控提供科学依据。方法 汇总分析青海省1958―2020年藏系绵羊引发的人间鼠疫疫情资料,描述其时间、地区和人群分布及其他流行病学特征;对38株分离自人、藏系绵羊和喜马拉雅旱獭的鼠疫杆菌进行测序,再结合其他参考菌株的基因序列分析菌株的全基因组单核苷酸多态性特征,构建菌株之间的系统发育关系。结果 1958―2020年共发生藏羊为疫情传染源的人间鼠疫疫情16起,发病69人,死亡42人,病死率60.86%。与藏系绵羊相关的鼠疫杆菌都位于系统发育树的同一进化分支1.IN2中,并具有明显的地域性特征。同一鼠疫事件中人、藏系绵羊和周边喜马拉雅旱獭分离菌株位于同一簇群,与流行病学调查资料相符。结论 流行病学结合系统发育关系分析,证实了青海省人间鼠疫来自藏系绵羊,而藏系绵羊鼠疫则起源于旱獭。藏系绵羊是青海高原上重要的家畜,因此不应低估藏系绵羊鼠疫的危害。

青海省海北藏族自治州鼠疫耶尔森菌病原学分析及流行病学意义

目的探讨青海省海北藏族自治州(海北州)鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)病原学特征及流行病学意义,为该地区的鼠疫防控提供科学依据。方法对1956-2011年间青海省海北州祁连、门源、海晏、刚察4县中分离的104株鼠疫菌进行生化糖醇类试验、毒力因子检测、毒力判定、质粒分析及细菌差异区段(DFR)分型等研究。结果根据生化分型指标,104株菌株中有73株为青藏高原型,25株为祁连山型,6株与青海省鼠疫自然疫源地生态型不一致,所有菌株均携带分子质量为6×10~6、45×10~6、52×10~6的质粒,74.04%(77/104)的鼠疫菌含有4个毒力因子,98.51%(66/67)的鼠疫菌为强毒株。DFR分型有6个基因组型,其中8型有75株,44型20株,5型6株,6型、7型和11型各1株。结论青海省海北州分离的鼠疫菌具备青藏高原鼠疫病原体特性,生态类型复杂,鼠疫菌毒力强,需加强该地区鼠疫的监测、防控和宣传力度。

青海省果洛藏族自治州鼠疫耶尔森菌病原学分析及耐药相关基因检测

目的对青海省果洛藏族自治州(果洛州)鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行病原学分析及耐药相关基因检测,为该地区的鼠疫防治提供科学依据。方法对1978-2016年间青海省果洛州分离的13株鼠疫菌进行糖醇类酵解试验、毒力测定、毒力因子检测、质粒分析及鼠疫菌基因差异区段(DFR)分型等研究,并根据美国国立生物信息中心(NCBI)公布的耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、ctx-m基因和耐磺胺类药物sul1、sul2基因序列,在每个基因上设计1对引物,以该13株鼠疫菌DNA为模板分别进行上述6个耐药基因的PCR扩增,以检测其是否携带耐药相关基因。结果根据生化分型指标,13株被试菌株中9株为青藏高原型,4株为祁连山型。毒力测定结果显示,13株被试菌株均为强毒级别的鼠疫菌,13株菌中有11株具备鼠疫菌特有的4个毒力因子,被试菌株携带相对分子质量分别为6×106、45×106、65×106和6×106、45×106、52×106的2种质粒谱。DFR分为4个基因组型,5型(7株)、8型(4株)、36型和01b型(各1株)。耐药基因检测结果显示,阴性对照和阳性对照均成立的情况下,所测13株鼠疫菌的PCR检测结果均为阴性,未发现耐链霉素、耐β-内酰胺类抗菌药物及耐磺胺类药物的菌株。结论青海省果洛州分离的鼠疫菌具备青藏高原鼠疫病原体特征,鼠疫菌的毒力强,但尚未出现耐抗菌药物菌株,但仍需加强鼠疫监测和鼠疫防治知识宣传力度,严防动物间鼠疫波及人间。

TaqMan-小沟结合物荧光探针对青海省青南地区104株鼠疫菌链霉素耐药基因rpsL突变位点的筛查

目的了解青海省青南地区rpsL基因点突变引起鼠疫菌耐链霉素的现状,为今后青南地区突发人间鼠疫的精准临床用药及预防耐药发生提供理论依据。方法筛选1957—2009年青海省青南地区取自鼠疫患者、媒介昆虫体内及中间宿主的104株代表性鼠疫菌,用赫氏平皿进行分离培养,采用十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取代表性鼠疫菌的DNA,针对我国链霉素耐药基因rpsL基因设计引物及TaqMan-小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针Probe1[FAM]和Probe2[VIC],利用TaqMan-MGB荧光探针的实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,对青南地区104株鼠疫菌链霉素耐药位点rpsL基因的突变情况进行检测。结果青南地区104株被试菌株FAM检测结果均为阳性,对应检测rpsL(128:A),相对荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)峰值>1000,阴性<200。所有被试菌株VIC检测结果均为阴性,对应检测rpsL(128:G),RFU峰值<200,阳性>1000。即青南地区104株鼠疫菌中未发现耐链霉素rpsL基因点突变菌株。结论了解到青南地区鼠疫菌耐链霉素菌株分布情况,为青南地区预防耐药发生以及鼠疫菌临床治疗提供了基础数据。

黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫杆菌病原学特征

目的了解甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌病原学及流行病学特征,为制定该地区鼠疫防控策略提供科学依据。方法对1962-1991年甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地不同宿主体内分离的49株鼠疫杆菌(Yersinia pestis)进行生化试验、毒力因子鉴定(F1、VW、Pgm、PstI)、质粒分析和差异区段(DFR)分析;选取17株鼠疫菌进行小鼠毒力测定,计算最小致死量(MLD)。结果49株被试菌株中,甘肃会宁县和靖远县分离的18株鼠疫菌生态型为黄土高原B型,宁夏海原县、西吉县及固原县分离的31株鼠疫菌生态型为黄土高原A型。49株被试菌株均能产生F1和PstI,其中75.5%(37/49)的鼠疫菌具备4个毒力因子;17株代表性鼠疫菌的毒力测定结果显示,均为强毒菌。该疫源地鼠疫菌共携带3种质粒,Mr为6×10^(6)、45×10^(6)、65×10^(6),形成了一种稳定的质粒谱;DFR分型研究共发现10个基因组型,分别为1b型1株、7型1株、9型1株、11型1株、13型10株、17型4株、20型1株、26型16株、41型1株、43型1株,其主要基因组型为26型和13型。结论甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌生态型较为特殊,且毒力强,人类感染鼠疫后多为重症型,病死率高。因此,应加大该地区的鼠疫监测力度,严防动物鼠疫波及人间。

青海省海南藏族自治州鼠疫疫源地鼠疫菌规律成簇的间隔短回文重复基因分型研究

目的研究青海省海南藏族自治州(简称“海南州”)鼠疫疫源地鼠疫菌的规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因型及其地区分布,为该疫源地的鼠疫防控工作提供科学依据。方法1954—2009年海南州鼠疫疫源地内不同宿主动物和媒介昆虫体内分离的36株代表性鼠疫菌株为实验对象,采用传统的十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA。应用3对CRISPR引物(YPa、YPb、YPc)分别对被试菌株DNA进行PCR扩增、测序和分析,确定海南州鼠疫疫源地鼠疫菌的CRISPR基因型。结果36株鼠疫菌中共发现17种非重复间区序列(spacer),其中YPa 9种、YPb 5种、YPc 3种。所有鼠疫菌株被分为5个CRISPR基因簇(Cb2、Cb4'、Ca7、Ca7'、Ca35'),6个基因型(G1、G9、G22、G22-a1'、G26-a1'、G26-a1'a4-),其中G26-a1'型为主要基因型,分布于共和县、贵德县、兴海县;其次是G22型,分布于共和县、贵德县。结论海南州鼠疫疫源地鼠疫菌CRISPR位点遗传多态性较高,不同基因型的鼠疫菌地区分布特征显著。

甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌携带耐药及耐消毒剂基因的调查

目的了解甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地内分离的鼠疫菌携带耐消毒剂及耐药相关基因的状况,为指导该疫源地在今后的鼠疫防治工作中合理使用抗菌药物和消毒剂提供参考依据。方法利用常规的十二烷基硫酸钠(SDS)裂解,酚-氯仿抽提方法对甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地境内分离的49株鼠疫菌进行DNA染色体的提取,DNA终浓度稀释至0.002μg/μl,并对耐氨基糖苷类链霉素基因(strA、strB)、耐β-内酰胺类药物相关基因(tem、ctx-m),耐磺胺类药物相关基因(sul1、sul2)及耐季铵盐类消毒剂基因(qacEΔ1-sul1)7对引物按设定的PCR反应体系逐一进行PCR扩增,同时设阳性对照和空白对照。结果通过PCR扩增在49株鼠疫菌中未检测出耐氨基糖苷类链霉素基因(strA、strB)、耐β-内酰胺类药物相关基因(tem、ctx-m),耐磺胺类药物相关基因(sul1、sul2)及耐季铵盐类消毒剂基因(qacEΔ1-sul1)。结论甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地分离的49株鼠疫菌不具有耐消毒剂及耐药相关基因的特征。

Association Between Himalayan Marmot Density and Climatic Factor

Objective:This study aims to explore the association between the density of Himalayan marmot (Marmota himalayana) and climatic factors such as temperature, precipitation, humidity, vapour pressure, sunshine percentage, wind velocity, which are closely associated with global climate change, and to provide a reference for plague prevention and control. Methods: We conducted a regression analysis to find the possible climate factors associated with the density of Himalaya marmot, and analyzed the response characters of Himalayan marmot to climate change.Results: Dailyprecipitation days(>=0.1 mm) and sunshine percentage were significantly associated with thedensityofHimalayan marmot(p<0.01). Conclusion: Climate change was associated with the risk of plague. This phenomenon is valuable for Himalayan marmot and plague prevention. More studies are needed to understand the impact of climate change on Himalayan marmot and plague.