ApiAP2转录因子家族调控弓形虫生长发育的研究进展

弓形虫病是世界范围内危害最为严重的人兽共患寄生虫病之一。WHO数据显示,全球人群弓形虫抗体阳性率在25%—50%。孕妇感染弓形虫引起的垂直传播严重危害胎儿及婴幼儿健康,弓形虫感染也是引起免疫缺陷病人死亡的主要因素。在畜牧生产中,弓形虫病引起孕畜流产、死胎,危害严重。弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内原生动物寄生虫,属于顶复门原虫,生活史复杂,包括在中间宿主(人类和其他温血动物)的无性增殖和在终末宿主(猫科动物)的有性繁殖。为完成弓形虫在中间、终末宿主复杂的生命周期,其在不同发育阶段的转化及生长需要严格而精准的基因调控,因此揭示弓形虫生长发育的调控机制对治疗性药物和疫苗的研发具有重要意义。ApiAP2转录因子是一类具有AP2结构域和强大调节功能的蛋白家族,在疟原虫、弓形虫等寄生虫的生长发育中发挥核心调控作用,是阐明弓形虫不同生活史阶段发育与转化调控机制的突破口。弓形虫作为顶复门原虫研究的模式生物,有67个含AP2结构域的转录因子被注释,部分转录因子在弓形虫生命周期生长发育和转化过程中发挥核心调控功能,但尚有大部分AP2转录因子的生物学功能未知,尤其是针对有性繁殖阶段发育调控的研究较为匮乏。本文对已报道的弓形虫AP2转录因子的研究手段、生物学功能、调控的互作基因及网络进行系统梳理,旨在挖掘对弓形虫生长发育的重要节点起核心调控作用的基因或分子,在微观分子层面初步勾勒出弓形虫复杂生活史不同生长发育时期的调控机制,并对其在新型药物和疫苗研发中的作用及潜能进行展望。以期为动物弓形虫病的防控提供新的思路和切入点,阻断人弓形虫病的感染源,践行“人病兽防、关口前移”,实现“同一世界、同一健康”。

竞争ELISA和间接ELISA方法应用于牛布鲁氏菌病净化的研究

旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA初筛、iELISA确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA用于布病初筛,iELISA用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。

一株鸽副黏病毒Ⅰ型分离鉴定及致病性分析

在天津的病死鸽病料中分离鉴定鸽副黏病毒Ⅰ型(pigeon paramyxovirus-1,PPMV-1),并对其进行遗传演化、生物学特性、致病性分析,为鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗的研发提供科学依据。采用RT-PCR方法进行病原检测,在SPF鸡胚上分离纯化病毒;经遗传演化分析、致病性分析及动物回归试验对病毒分离株进行全面分析。结果显示:病死鸽的脏器样品经RT-PCR鉴定为NDV核酸阳性;鸡胚分离纯化后得到1株鸽副黏病毒Ⅰ型毒株,命名为Pigeon/TJ/CH/020/2020(TJ20)。通过对病毒F基因测序及进化树分析,确定该分离毒株属于ClassⅡ类Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型,裂解位点的氨基酸残基为112 R-R-Q-K-R-F^(117),符合NDV强毒株的分子特征。交叉血凝抑制试验显示TJ20株与LaSota疫苗株存在明显的抗原性差异。TJ20株的鸡胚半数感染量(EID_(50))为10^(-8.38)·0.1 mL^(-1)、细胞半数感染量(TCID_(50))为10^(-8.64)·0.1 mL^(-1)、鸡胚平均致死时间(MDT)为62 h、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.19。动物感染试验结果表明,1月龄鸽人工感染TJ20株后第4天开始出现嗜睡、垂翅、腹泻、瘫痪、斜颈扭头等新城疫典型临床症状,发病率和死亡率均为100%。本研究从病死鸽组织中成功分离出一株具有高致病性的Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型的TJ20毒株,为后续鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗研发提供了重要的生物学材料。

基于cELISA检测的绵羊抗布鲁氏菌病性状全基因组关联分析

【目的】挖掘与绵羊布鲁氏菌病抗性或易感性相关的基因,以期为绵羊布鲁氏菌病抗病育种提供分子标记。【方法】以自然感染布鲁氏菌病并且未注射疫苗的绵羊为研究对象,采集50只绵羊的血液样本进行竞争酶联免疫吸附试验(competitive enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA)。对绵羊血液DNA进行全基因组重测序,以cELISA结果为数量性状表型,利用GEMMA软件进行全基因组关联分析。使用clusterProfiler软件包对显著基因进行功能富集分析。【结果】全基因组关联分析筛选到Top 1000的位点共注释到56个基因,GO功能富集结果显示,注释基因主要富集在β选择和αβT细胞增殖和分化等条目;KEGG通路富集分析结果显示,注释基因主要富集在Th1/Th2/Th17细胞分化和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等通路,主要涉及γ-干扰素受体1(interferon gamma receptor 1,IFNGR1)、活化T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFATC2)、NF-κB抑制因子β(NF-κB inhibitor beta,NFKBIB)、脾酪氨酸激酶(spleen associated tyrosine kinase,SYK)、转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor 2,TGFBR2)和T细胞受体相关蛋白激酶70的Zeta链(Zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70,ZAP70)共6个基因,筛选到的条目、通路和基因与布鲁氏菌的感染或宿主的抗感染密切相关。【结论】本研究筛选到6个与绵羊布鲁氏菌病相关的基因,为进一步细胞或个体水平的功能验证奠定了基础,为绵羊布鲁氏菌病抗病育种分子标记提供了参考。

艾美耳球虫的遗传操作:平台建立、应用与展望

艾美耳属球虫是畜牧生产中最常见的寄生虫,引起鸡、兔、羊、牛等养殖动物严重消化系统疾病,影响动物健康和养殖效益。随着分子生物学技术的飞速发展,研究者们先后建立了艾美耳球虫的瞬时转染、稳定筛选和基因编辑等遗传操作平台,实现了艾美耳球虫的基因过表达、基因敲除和基因编辑等操作,极大推进了艾美耳球虫基础生物学和作为新型真核载体疫苗的研究进展,但仍面临一些挑战。本文围绕艾美耳球虫遗传操作平台建立的关键技术、创新性设计、存在的技术瓶颈以及应用前景进行系统梳理和总结,为其他畜禽寄生虫遗传操作平台的构建提供参考,也为球虫病新型防控制剂的研制提供新的思路。

非洲马瘟诊断技术研究进展

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)引起的一种以发热、皮下水肿及脏器出血为特征的马属动物急性和亚急性虫媒传染病,具有高传染性和快速致病的特点,被世界动物卫生组织列为法定报告疾病,中国也将其列为一类动物疫病。世界动物健康信息系统数据显示,AHS近几年在非洲和与中国邻近的东南亚地区流行,形势非常严峻,严格监测边境地区和口岸的马属动物AHS,及时清除带毒动物是中国AHS防控的法定策略。笔者对AHS的病原学和血清学检测技术研究进展进行了整理和总结。病原学诊断技术主要包括病毒分离、RT-PCR、恒温扩增和基因芯片技术等,其中病毒分离是经典的确诊方法,RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR技术为常用的实验室诊断方法,恒温扩增技术如环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和重组酶介导的扩增技术(RAA)等可用于现场快速诊断,基因芯片技术可实现多病原检测。血清学诊断包括ELISA、病毒中和试验和补体结合试验等。其中RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR和ELISA均为世界动物卫生组织和《非洲马瘟诊断技术》(GB/T 21675—2022)推荐的主要检测方法。近些年来,基于高通量测序的宏基因组技术能同时对多种病原体进行定量检测,极大提高了疾病诊断的准确性和效率;基于云平台和物联网的疾病智能监测和预警系统等新技术的发展与应用,将为AHS的监测和预防提供更为科学和精确的技术支持。

宏基因组技术诊断亲内皮疱疹病毒感染致濒危亚洲象死亡病例

本研究旨在借助宏基因组测序分析技术快速发现引起濒危亚洲象死亡的可能病原,再结合常规诊断技术,对大象病因进行分析和确诊,为大象相关疫病的快速诊断和预防提供参考。对死亡大象进行尸检,取心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、肌肉、胃、十二指肠、空肠、结肠、盲肠、胰腺等器官制备切片,进行HE染色和病理分析;取腹股沟淋巴结进行宏基因组测序分析;使用特异性PCR方法对特征基因进行扩增和测序,经序列比对绘制进化树,分析其与其他毒株的进化关系。结果显示,死亡大象的剖检和病例切片结果符合象亲内皮疱疹病毒感染的特征,宏基因组分析结果显示,大象的腹股沟淋巴结中含有大量的象β疱疹病毒1型(即亲内皮疱疹病毒)。该大象死亡的原因可能是象亲内皮疱疹病毒感染所致,宏基因组技术对大象亲内皮疱疹病毒感染以及其他濒危动物病例的快速诊断具有良好的应用前景。

某小型肉牛屠宰场产气荚膜梭菌定量风险评估

为探明小型屠宰场生产牛肉中产气荚膜梭菌的消费风险及其生产链中的关键风险防控点,以北京市某小型肉牛屠宰场不同样品的产气荚膜梭菌污染监测数据和调研数据为基础,构建了牛肉中产气荚膜梭菌定量风险评估模型,并通过@Risk软件模拟运行分析。通过模型模拟的屠宰后单头牛胴体表面产气荚膜梭菌污染量90%的可能分布在102.00~563.00 CFU,平均值为280.84 CFU,而实际监测数据拟合为291.17 CFU,说明模型可信。根据屠宰过程中各环节的模拟数据,构建了牛胴体表面携带产气荚膜梭菌消长变化图,发现产气荚膜梭菌携带量从剥皮后的122.31 CFU/头上升至屠宰后的280.00 CFU/头,屠宰环节携带量为0.11 CFU/100 g,而销售环节升至4.95 CFU/100 g。通过模型对各变量参数进行敏感性分析,发现胴体表面产气荚膜梭菌污染对牛肉产气荚膜梭菌污染的风险贡献最大(R=0.69),其次是空气中的带菌量,而销售环节100 g牛肉携带产气荚膜梭菌的风险主要与从屠宰到销售过程中牛肉带菌量变化有关(R=0.96)。可见,屠宰过程中肉牛的本底携带、空气中带菌量以及储运销售过程中的交叉污染是牛肉中产气荚膜梭菌污染的关键控制点。结合剂量-反应关系和膳食数据,模型评估的本屠宰场生产牛肉中产气荚膜梭菌引发的感染风险每年不足1例,风险极低。本研究构建了小型肉牛屠宰场屠宰过程中产气荚膜梭菌定量风险评估模型,可为牛屠宰场产气荚膜梭菌污染的风险管理提供参考。

细胞和病毒活疫苗中支原体污染的PCR检测方法建立与应用

【目的】在生物学研究及生物制品生产中易发生支原体污染,针对我国当前支原体检验方法在时效性和敏感性上的不足,建立一种简便快速、特异敏感的支原体检验PCR方法。【方法】从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的核糖体rRNA小亚基(16S/18S, SSU)参考序列的库文件SILVA_123_SSURef,从中提取全部支原体序列,经去重复后得到181条(种)支原体(包括139个已分类的单一种类和42个未分类的支原体)的16S rRNA序列,经比对后选取高变区V6到V9为检测目标区段,设计筛选出表现最佳的检测引物,建立检测支原体的通用PCR方法。选取12种常见的支原体或2种甾原体作为待检样品对该PCR方法进行检测范围验证;取6种不同动物来源的常用传代细胞和3种常见细菌进行特异性验证;选取了5种最常见的支原体和1种甾原体进行敏感性试验;并将其与经典培养法一同对17批(种)动物病毒活疫苗(分别用于6种动物)和24份8种细胞培养物样本进行对比检测以评价其实际应用效果。【结果】建立了一种通用的支原体PCR检测方法,检测引物由2条上游引物(5′-GCAAARCTATRGARAYATAGYVGAG-3′和5′-GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3′)和1条下游引物(5′-CCARCTCYCATRGTKTGACGG-3′)组成,引物配比为3﹕1﹕4,最佳退火温度为56℃。采用该PCR方法对14个较常见的支原体种类进行检测,结果均能扩增出396—413 bp大小的特异性条带,表明该方法的检测范围符合检测要求;对6种动物传代细胞和3种常见细菌进行检测,结果均未扩增出特异性条带,表明其特异性良好;灵敏度测定结果表明该PCR方法的检测下限可达20—200 CCU的活菌,对应的核酸为1.5—15.0 pg;对共计17批病毒活疫苗和24份细胞样品的检测结果与培养法检测结果基本一致,表明本研究建立的支原体PCR检测方法与培养法有很好的一致性,而且敏感性更高。【结论】建立的支原体PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、简单快速,为细胞及病毒活疫苗中可能的支原体污染提供了一种准确可靠的快速检测方法。

一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定

本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法,并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株,命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况,并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞(RAW264.7)中生存能力等与光滑型菌株进行了比较研究。结果显示,试验成功获得了诱导突变株,其缺失片段大小为15070 bp;热凝集试验阳性,能被结晶紫染色,吖啶黄凝集试验阳性;对提取脂多糖进行银染,结果显示O链缺失,诱导株RB71脂多糖不完整;连续传代30次,PCR检测未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,诱导株RB71生长速度显著低于亲本株A19;入侵RAW264.7细胞72 h时,其胞内存活率与亲本株相比极显著下降(P<0.01)。综上所述,本试验开发出一种能高效诱导光滑型布鲁氏菌变异为粗糙型布鲁氏菌的试剂及诱导方法,成功获得一株具有良好遗传稳定性的粗糙型减毒布鲁氏菌RB71诱导株,该诱导株在RAW264.7细胞内的存活能力显著变弱,这为新型弱毒布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技术基础。

羊种布鲁氏菌WadC基因缺失株的构建与鉴定

试验旨在分析糖基转移酶编码基因WadC影响布鲁氏菌胞内存活的作用。以羊种布鲁氏菌Rev.1基因组为模板,通过同源重组方法获得WadC基因上、下游同源臂融合片段,并与载体pUC19-SacB连接,构建pUC19-SacB-ΔwadC重组载体,电转至羊种布鲁氏菌Rev.1,构建ΔwadC缺失株(Rev.1ΔwadC),检测菌株Rev.1ΔwadC的遗传稳定性,比较分析亲本株Rev.1和缺失株Rev.1ΔwadC的生长特性及其在BMDC和RAW264.7细胞中的生存能力。结果显示,试验成功构建基因缺失株,连续传代30次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株Rev.1ΔwadC与亲本株Rev.1生长趋势相似,均在20 h到达对数生长期,44 h进入平台期;侵染BMDC细胞48和72 h时,其胞内存活率显著低于亲本株(P<0.05);而侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞试验显示,亲本菌株和基因缺失株无显著性差异(P>0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌WadC基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在BMDC细胞内的存活能力显著变弱,为深入研究布鲁氏菌WadC基因功能奠定基础。

一株鹿源牛种布鲁菌的鉴定及全基因组分析

本研究旨在对一株鹿源牛种布鲁菌(Brucella abortus)BJ1进行全面鉴定,为研究鹿的布鲁菌病提供参考。将B.abortus BJ1培养后,挑取单菌落分别接种到含硫堇或碱性品红的TSA培养基,观察其生长状态;将接种有B.abortus BJ1的TSA平板分别置于普通生化培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅培养基测定B.abortus BJ1生长过程中是否产生H2S;通过结晶紫染色和热凝集试验测定B.abortus BJ1的表型;通过平板凝集试验测定B.abortus BJ1单因子血清反应性;采用AMOS-PCR鉴定细菌种属;为测定其毒力,以1×109CFU感染豚鼠,14 d后测定豚鼠每克脾组织的含菌量。使用二代测序方法测其全基因组序列并对其进行分析和注释,将结果与B.abortus 2308比对,并通过Mauve软件进行系统进化分析。结果显示:B.abortus BJ1不依赖CO2,产H2S,可以在含硫堇和碱性品红的培养基上生长;表型为光滑型,与M因子血清发生凝集;豚鼠脾含菌量为1.17×10^6~2.05×10^6CFU·g^-1;基因组大小为3 270 584 bp,在基因编码区内与B.abortus 2308株相比有46处Indel差异,进化树分析显示与B.abortus 8416有较高的同源性。通过全面鉴定,确定B.abortus BJ1为牛种9型,为更深入地了解我国布病发生情况和鹿的布病防控提供参考。

犬种布鲁氏菌研究进展

犬种布鲁氏菌属于6个经典种布鲁氏菌之一,为天然粗糙型,毒力较弱。长期以来,由于犬种布鲁氏菌对人类致病性较低,其危害一直被忽视。自1966年在美国发现该菌以来,已传播至世界多地。近年来,随着养犬业的不断发展及宠物犬数量的增多,犬布鲁氏菌病发病率不断上升,在某些地区已成为流行性疫病,且对人类公共卫生安全的威胁也日益加重。目前,犬种布鲁氏菌感染导致的犬布鲁氏菌病尚无可靠的诊断方法及有效的疫苗。鉴于此,在查阅相关文献的基础上,笔者对犬种布鲁氏菌的病原学、流行病学、致病机理、检测方法、疫苗研究等方面的相关研究进展进行综述,以期为犬布鲁氏菌病的深入研究和防控提供参考。

再论采用双重投影法的椭球面日晷投影

为减小椭球面日晷投影的变形,讨论了椭球面日晷投影的特性,分析了3种球面下双重投影法的变形大小,结果表明采用高斯等角球面,投影长度变形最小,适合于各种比例尺的地图海图制图,可以使船只沿着拟大地线方向航行,迅速到达目的地。

牛种布鲁氏菌ClpS基因突变株的构建及其对毒力的影响

试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株2308和突变株ΔClpS两者之间的差异。结果显示,在相同的培养条件下,亲本株2308和突变株ΔClpS的细菌浓度无明显差异,且两者提取的LPS银染结果基本一致,表明ClpS基因突变不影响布鲁氏菌生长速度,不影响细菌LPS合成;在细胞感染模型中,突变株ΔClpS在感染后72 h的胞内存活能力极显著低于亲本株2308(P<0.01);小鼠感染试验显示,在感染后1周,亲本株2308感染组和突变株ΔClpS感染组小鼠脾脏重量及细菌含量无显著差异,但在感染后4周,突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏细菌含量为103.93 CFU/g脾脏,显著低于亲本株2308(106.68 CFU/g脾脏,P<0.01),且突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏肿胀程度极显著低于亲本株2308(P<0.01)。综上所述,布鲁氏菌ClpS基因突变不影响细菌生长速度及细菌LPS合成能力,但ClpS基因突变可降低布鲁氏菌在小鼠脾脏内的定殖能力。

常用消毒剂对布鲁氏菌疫苗株的灭菌效果评估

【背景】布鲁氏菌是一种重要的人畜共患胞内寄生菌,是引起动物和人发生布鲁氏菌病(布病)的病原体。高效消毒剂杀灭环境中的布鲁氏菌是防控布病的关键措施。【目的】评价市面上常用消毒剂对布鲁氏菌的灭菌效果及差异。【方法】选用市面上9种不同类型的常用消毒剂,以高、中、低3种不同使用浓度分别研究其对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌的杀灭效果。同时根据消毒剂的有效浓度通过最小抑菌浓度实验确定各消毒剂的最小抑菌浓度。【结果】除苯酚外,其余8种消毒剂,包括聚维酮碘、癸甲溴铵、苯扎溴铵、戊二醛、复合季铵盐、乙醇和2种商品化消毒剂等在推荐使用浓度下5 min内均能完全杀灭布鲁氏菌,碘酸制剂在0.1%低使用浓度下细菌存活率为0.000039%-0.000095%。苯酚按0.5%的推荐剂量,作用5 min后细菌存活率为0.000144%-0.000183%,20 min后,细菌存活率为0.000138%-0.000193%;按1%的使用剂量作用5 min后,猪种布鲁氏菌存活率为0.000125%,作用20min后的存活率下降至0.000038%。最小抑菌浓度研究结果表明,季铵盐类消毒剂其最小抑菌浓度大致在0.01563%-0.03125%之间,其余消毒剂的最小抑菌浓度结果与消毒剂最低推荐使用浓度基本一致。研究同时发现,不同种属布鲁氏菌对同一消毒剂的敏感性也存在一定差异。【结论】研究结果为生产实践中科学选择布鲁氏菌消毒剂提供了借鉴。

布鲁氏菌粗糙型RA343株与光滑型A19株免疫小鼠后特异性T细胞和抗体动态变化分析

【背景】布鲁氏菌病(简称布病)严重威胁着人类健康和畜牧业的发展,使用毒力弱、免疫原性好、不干扰血清学诊断的疫苗是防控布病的有效措施。【目的】比较布鲁氏菌粗糙型RA343株与光滑型A19株免疫小鼠后机体特异性T细胞和抗体的动态变化,评价粗糙型RA343株的免疫效果。【方法】采用6周龄雌性BALB/c小鼠,共分为3组,RA343株免疫组和A19株免疫组各15只小鼠,空白对照组5只小鼠。免疫组的每只小鼠经腹股沟皮下注射0.1 mL(含菌量为1×10^(8) CFU)菌液。免疫后1、2和3周各免疫组及空白对照组分别剖杀5只小鼠,无菌取脾脏,一部分脾脏研磨分离淋巴细胞,用流式细胞术检测小鼠布鲁氏菌特异性CD4^(+)T细胞与CD8^(+)T细胞所占比例的变化趋势;另一部分脾脏称重后分离布鲁氏菌RA343株和A19株,评估RA343株和A19株在小鼠脾脏中的定殖情况。在剖杀小鼠的同时取外周血分离血清,用ELISA方法检测免疫后小鼠血清中IgM和IgG抗体的消长规律。采用GraphPad Prism 8.0软件作图并进行统计学分析。【结果】与A19免疫组相比,免疫后1周,RA343免疫组小鼠脾脏布鲁氏菌特异性CD4^(+)IFN-γ所占比例极显著增加(P<0.01),CD4^(+)IL-2、CD8^(+)IL-2和CD8^(+)TNF-α所占比例显著增加(P<0.05);免疫后2周,RA343免疫组特异性CD4^(+)TNF-α所占比例极显著增加(P<0.01),CD8^(+)TNF-α所占比例显著增加(P<0.05);免疫后3周,CD4^(+)TNF-α所占比例显著增加(P<0.05),CD8^(+)IFN-γ所占比例极显著增加(P<0.01)。免疫后1-3周,RA343免疫组小鼠脾脏含菌量显著低于A19免疫组(P<0.05),而且RA343免疫组脾脏重量低于A19免疫组。光滑型A19株免疫小鼠的IgM和IgG抗体水平在免疫后2周均显著升高;粗糙型RA343株免疫小鼠的IgM和IgG抗体采用光滑型抗原进行ELISA检测结果均为阴性。【结论】与光滑型A19株相比,布鲁氏菌粗糙型RA343株诱导的细胞免疫应答较强,而且RA343组小鼠脾脏含菌量显著低于A19组,产生抗体与光滑型布鲁氏菌抗原无交叉血清学反应,综合表明布鲁氏菌粗糙型RA343株毒力弱,免疫小鼠后可产生良好的细胞免疫反应和体液免疫反应且不干扰血清学诊断,是理想的布鲁氏菌疫苗候选株。

Study on the structure of heteropolymer pp38/pp24 and its enhancement on the bi-directional promoter upstream of pp38 gene in Marek’s disease virus

In the latest report, Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene was used as a reporter to investi-gate the influence of pp38 on its upstream bi-directional promoter, and it was found that the co-expression of pp38 and pp24 can significantly enhance the transactivity of the bi-directional pro-moter between pp38 gene and 1.8-kb mRNA transcript in genome of Marek’s disease virus (MDV). In this study, enhanced green fluorescence protein (EGFP) gene was used as another reporter to further investigate the promoter activity. The transfection shows the promoter has the complete activity under the condition of co-expression of pp38 and pp24 in the same cells. Immunoprecipitation test was used to verify the structure of pp38/pp24 heteropolymer. The pp38-specific monoclonal antibody H19 was used in this test, and pp38, pp24 or both were prepared from the pcDNA-pp38, pcDNA-pp24 or pBud-pp38-pp24 transfected chicken embryonic fibroblast (CEF), respectively. Immunoprecipitation indicates that pp24 could be co-precipitated with pp38 by MabH19, implying that pp24 and pp38 were able to form a heteropolymer in the natural condition. The two separated tests clarify that pp38 and pp24 form a heteropolymer, which enhances the activity of the promoter.