人类免疫缺陷病毒感染细胞的Rer蛋白依赖性凋亡引导

目的:以人类免疫缺陷病毒(HIV)调节蛋白Rev与Rev反应区(RRE)的高亲和性建立引导HIV感染细胞凋亡的结构。方法:用分子克隆技术合成含RRE和肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)的Rev依赖性凋亡引导质粒,流式细胞仪检测质粒表达。结果:新质粒pDM128-TNF-R1(pT128)HindIII内切有3.1、2.7、1.0和0.87kb片段;聚合酶链反应(PCR)法检测示TNF-R1的1360bp片段。DNA测序法确认其准确性。单纯Hup60TNF-R1在pDC302(pT60)转染Hela,TNF-R1表达可明显杀伤Hela(P<0.01),Rev存在时,pT128也能表达TNF-R1杀伤Hela(P<0.01),但不及pT60的作用(P<0.01);无Rev时,pT128不表达TNF-R1,不杀伤Hela(P>0.01)。单纯Rev不杀伤Hela(P>0.01)。pT128与pRev共转,TNF-R1表达较pT60慢(P<0.01),40h后才接近单纯pT60。结论:新质粒具有Rev依赖性表达作用,进而引导Rev表达细胞凋亡。

Rev依赖性人类免疫缺陷病毒检测结构的合成与表达

目的 利用人类免疫缺陷病毒 (HIV)低变异的调节蛋白Rev与Rev反应区 (RRE)的高亲和性 ,尝试合成一种不受变异影响的特异性病毒表达检测结构。方法 采用分子克隆技术合成含有RRE和增强的绿荧光蛋白 (EGFP)的Rev依赖性荧光表达质粒 ,采用流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果 新合成的质粒pDM 12 8 EGFP (pE12 8)含氨苄青霉素受体 (AmpR)选择子、SV40 启动子、EGFP基因及HIV 1 RRE片段 ,BssSI酶切后产生 3 .6、1.9和 1.5kb片断 ,HindⅢ酶切后产生 3 470、2 72 5和 879bp 3个片断 ,PCR扩增提示EGFP基因完整插入。pE12 8在Hela细胞中显示Rev依赖性表达 ,pRev不存在时 ,几乎没有EGFP表达 ;pRev存在时 ,EGFP显著表达 (P <0 .0 1)。绿荧光Hela细胞百分比随pRev比例的增加而渐次增加。结论 pE12 8能特异、敏感、快速和直观地检测HIV的表达 ,对反映HIV的感染性及病情的转归及对获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)

以Rev依赖性凋亡增强HIV-1 gp160的抗原性

目的 检测Rev(HIV的调控基因 )依赖性肿瘤坏死因子受体 (TNFR 1)和gp16 0双重表达质粒pDM12 8 TNFR 1(pT12 8)的凋亡诱导功能。方法 采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果 新结构具有特异的选择性表达作用。当Rev存在时 ,能间接表达TNFR 1,明显诱导HeLa细胞凋亡 ,使绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。等质量转染时 ,TNFR 1表达量少于Hup6 0TNFR 1的pDC30 2 (pT6 0 ) ,故间接表达不及单纯pT6 0的直接表达 ,绿荧光细胞百分率显著高于pT6 0转染组 (P <0 .0 1)。培养 40h ,才有明显杀伤功能并接近单纯pT6 0 ,差异无显著性 (P>0 .0 1)。单纯pT12 8不能直接表达TNFR 1,绿荧光细胞百分率非常显著地高于单纯pT6 0转染组 (P<0 .0 1) ,接近阴性对照 ,培养 40h时差异无显著性 (P >0 .0 1)。当AD8或pMD +pRnv存在并表达Rev时 ,pT12 8均能表达TNFR 1,杀伤HeLa细胞 ,绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。pT12 8与pRev或AD8转染人正常的角质生成细胞时 ,能表达TNFR 1,诱导细胞凋亡。培养 72h后 ,阴性对照和单纯pT12 8组的绿荧光角质生成细胞数皆显著地超过pT12 8+pRev和pT12 8+pAD8组 (P <0 .0 1)。结论 pT12

朗格汉斯细胞特异性递呈在巨噬细胞亲和性人类免疫缺陷病毒感染中的作用

目的 观察巨噬细胞亲和性HIV经皮肤感染的细胞学机制 ,区别巨噬细胞亲和性及T细胞亲和性HIV感染的差异。方法 以基因枪转染AD8及NL4 3分子克隆至皮肤 ,流式细胞仪和荧光显微镜观察病毒在表皮细胞中的表达 ,磁分离术分离CD80 + 和CD80 -的游离细胞 ,进而以PCR和逆转录酶检测游走细胞中HIV对CD+ 4 T淋巴细胞的感染和表达。结果 AD8及NL4 3经基因枪直接转染皮肤后 ,表皮游走细胞皆显示HIV转染 ,可扩增到gag基因。只有AD8转染的游走细胞能进一步感染CD4 + T淋巴细胞 ,CD4 + T淋巴细胞可扩增到gag并表达逆转录酶 ;含NL4 3的游走细胞 ,不能感染CD4 + T淋巴细胞 ,不能扩增到gag,不能表达逆转录酶。AD8转染的 1/ 2log稀释的CD80 + 细胞能够感染CD4 + T淋巴细胞。即使 4次稀释后 ,仍能感染CD4 + T细胞 ,PCR扩增到gag并有大量逆转录酶表达 ,超过对照组的 2～ 3倍。AD8转染的CD80 -细胞仅第 1次稀释与CD4 + T细胞共孵可扩增到gag,仍可见逆转录酶表达。进一步稀释后不能扩增到gag。NL4 3转染的CD80 + 或CD80 -游走细胞与CD4 + T细胞共孵 ,皆不能扩增到gag ,也无逆转录酶表达。结论 直接转染AD8的CD80 + 的游走表皮细胞能特异性地感染CD4 + T细胞。这种特异性不仅依赖于细胞表面HIV受体的亲和性结合 ,还依赖于转?