链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 I.在大肠杆菌中的启动子活性

用大肠杆菌转座子Tn5上去除了自身启动子区域的卡那霉素抗性基因(neo) 作为指示标记来探测广寄主、高拷贝的链霉菌质粒pIJ101上DNA的启动子活性所做的基因融合试验揭示,pIJ101上至少有两个可在大肠杆菌中行使启动子功能的DNA片段。基因融合后所产生的杂合质粒能够赋予大肠杆菌ED8767较高的卡那霉素抗性。对含质粒菌株在液体培养基中的生长动力学分析揭示,这种菌株在从无药物向有药物的生长环境中过渡时,生长并不受到暂时的抑制。说明这种启动子活性不是pIJ101DNA上DNA的突变所引起。用大肠杆菌的启动子探针载体pKK232-8所做的体外亚克隆试验更进一步证实了这项观察,并把两个启动子功能区分别缩小到0.54kb和1.18kb的范围内。这项试验成功地组建了质粒pIJ101的亚克隆库,便于对这个重要的链霉菌质粒进行精细的分子生物学研究。

链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 Ⅱ.在大肠杆菌中具有终止子活性片段的克隆和分析

在大肠杆菌的终止子探针载体pIJ667上,neo基因的正常表达可使寄主产生较强的卡那霉索抗性。然而,把链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的BclⅠ片段克隆到这个载体的BglⅡ位点,使neo的结构基因与其启动子隔开所做的克隆试验显示,有两个插入片段,BclⅠ-A和BclⅠ-E,可以有效地终止neo基因的转录,使大肠杆菌寄主对卡那霉素呈现敏感。这两个片段在pIJ101的限制性内切酶图谱上已得到了定位,其活性区域的大小分别为2.9和1.19kb。把pIJ101衍生的小质粒pIJ350上BclⅠ片段克隆到pIJ667中,不仅进一步暗示出pIJ101 BclⅠ-A片段上终止子功能的存在,而且把这个区域缩小到1.32kb的范围内。此外,这些终止子活性的表达显示出明显的方向性。