黑曲霉菌为宿主菌的重组表达性质粒的构建

目的 建立以pyrG基因为选择标志 ,以黑曲霉菌为宿主菌的蛋白质表达系统。 方法 以PCR扩增获得的黑曲霉菌 pyrG基因的部分序列片段为探针作两次噬菌斑原位杂交 ,从黑曲霉菌ATCC 12 0 49基因文库中克隆获得长度为 9.8kb的DNA片段 ,将其中含 pyrG基因的 2 .3kb片段亚克隆至表达性载体PIGF中 ,获得重组质粒。对克隆基因进行了全基因测定和分析。以黑曲霉菌ATCC 12 0 49的 pyrG缺陷株M 5 4为受体菌 ,用聚乙二醇 /氯化钙方法作基因转化实验 ,将重组质粒导入该受体菌并在其中表达。结果 从黑曲霉菌ATCC 12 0 49基因文库中克隆获得了pyrG基因 ,构建了含该基因的重组表达性载体 pYG1.2。序列分析表明该基因与黑曲霉菌L112的 pyrG基因编码序列的同源性为 93 .9% ,两者经推导的氨基酸的同源性为 98.9%。重组质粒 pYG1.2可使黑曲霉菌ATCC 12 0 49的 pyrG缺陷株M5 4发生基因转化 ,成为Pyr+ 。结论 在克隆了 pyrG基因的基础上成功构建了以 pyrG基因为选择标志 。