鲍曼不动杆菌荚膜通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进鼠巨噬细胞自噬和凋亡

目的:探讨不同厚度荚膜的鲍曼不动杆菌诱导鼠Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡的能力及潜在的机制。方法:从肺炎患者痰液中分离鉴定鲍曼不动杆菌,以刚果红染色法染色细菌荚膜并筛选荚膜厚度显著不同的菌株用于后续研究。分别以厚荚膜株(Ab-H株)和薄荚膜株(Ab-B株)感染Raw 264.7细胞,于感染后1 h、3 h和6 h时收集细胞,采用免疫印迹法检测细胞自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1表达,以及PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平,采用流式细胞术检测细胞活性氧生成量和凋亡率。结果:鲍曼不动杆菌经刚果红染色后,菌体染成紫黑色,背景染成红色,荚膜不着色,可以清晰地观察到细菌荚膜厚度。筛选出两株荚膜厚度差异显著的鲍曼不动杆菌,分别为Ab-H株和Ab-B株。上述菌株感染Raw 264.7细胞后均可以诱导细胞自噬和凋亡,并增加细胞活性氧生成量,PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平受到显著抑制,且抑制作用随着时间延长而增加(P<0.05)。Ab-H株细胞凋亡率、自噬相关蛋白Becline-1表达量和活性氧生成量显著高于Ab-B株(P<0.05)。结论:鲍曼不动杆菌能够诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡的发生,诱导能力与细菌荚膜厚度呈正相关;厚荚膜鲍曼不动杆菌有更强的诱导Raw 264.7细胞活性氧生成能力,以及抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化能力,最终导致Raw 264.7细胞自噬和凋亡。

建立ERIC-PCR技术快速分析不同耐药性鲍曼不动杆菌的同源性

目的建立肠杆菌科基因间重复序列引物PCR技术(ERIC-PCR技术)用于分析亚胺培南耐药和亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌同源性,为判断医院内感染发生提供一种简便的新方法。方法收集2018年3-6月江苏大学附属医院重症监护室患者痰液中分离的非重复鲍曼不动杆菌80株,其中包含50株亚胺培南耐药菌株,30株亚胺培南敏感菌株。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA,PCR扩增菌株ERIC序列,Quantity One软件分析不同耐药性菌株电泳条带以判断菌株同源性。结果 50株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌可分为6种基因型,其中最多的一种基因型有24株;30株亚胺培南敏感的鲍曼不动杆菌可分为20种基因型,其中最多的一种基因型仅有3株。结论该院ICU来源的亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌的基因型较少,提示该菌株可能发生了医院内感染。ERIC-PCR技术简单、方便,可以快速分析鲍曼不动杆菌同源性,适合于在各级医院中推广。

鲍曼不动杆菌诱导Raw 264.7细胞自噬研究

目的 探讨鲍曼不动杆菌诱导鼠巨噬细胞Raw 264.7发生自噬的能力。方法 鲍曼不动杆菌标准株(ATCC 17978)感染Raw 264.7细胞,于感染180 min时中止实验,收集细胞提取总RNA和总蛋白,通过Western boltting法检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达。同时通过qPCR法检测自噬相关基因atg3、atg4B、atg5、atg7、atg12、atg16L1、ULK1和GABARAPL1。结果 鲍曼不动杆菌感染Raw 264.7细胞后,细胞LC3和Beclin-1表达量较未感染组升高显著(F(LC3)=457.2;F(Beclin-1)=43.27,P<0.01),自噬相关基因表达量atg3、atg4B、atg5、atg7、atg16L1、ULK1、GABARAPL1变化并不明显,而atg12表达量在180 min时升高显著(F=208.6,P<0.01)。结论 鲍曼不动杆菌可以诱导鼠巨噬细胞Raw 264.7发生自噬,其机制可能是通过ATG12-ATG7-ATG5信号传导通路,但其确切机制有待于进一步研究。

肺炎患者痰液分离鲍曼不动杆菌耐药基因分析

目的:分析呼吸内科肺炎患者痰液分离鲍曼不动杆菌携带β-内酰胺酶基因及主动外排泵基因情况。方法:收集经生化鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌株160株,将鲍曼不动杆菌特异性片段(Ab-ITS)的二重PCR法确认为鲍曼不动杆菌者纳入研究。用PCR法检测鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因和主动外排泵基因,包括A类β-内酰胺酶(blaTEM、blaPER和blaCARB)、B类β-内酰胺酶(blaIMP和blaVIM)、C类β-内酰胺酶(blaADC和blaDHA)、D类β-内酰胺酶(blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51和blaOXA-58)和主动外排泵相关基因(adeB、adeJ、macB、emrB、emrA、abeS、abeM和craA)。以微量肉汤稀释法检测加入外排泵抑制剂羰基氰化氯苯腙(CCCP)前后,携带adeB基因鲍曼不动杆菌对亚胺培南的最低抑菌浓度(MIC)的变化。结果:临床分离160株醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体中鲍曼不动杆菌143株(占90%),包括亚胺培南耐药株119株(占83.2%)和敏感株24株(占16.8%)。所有鲍曼不动杆菌均检出blaOXA-51基因,其中,亚胺培南耐药株中检出blaOXA-23(98.3%)、blaTEM(41.4%)、blaADC(98.3%)和blaDHA(0.7%),blaPER、blaCARB、blaIMP、blaVIM、blaOXA-24和blaOXA-58均未检出;敏感株中未检出blaOXA-23。adeJ、macB、abeM和craA基因在143株鲍曼不动杆菌中的携带率均为100%;emrB、emrA和abeS基因携带率均超过80%。adeB基因在亚胺培南耐药株中检出117株(98.3%)。在CCCP干预试验中,携带adeB基因的鲍曼不动杆菌MIC50降低1/2。结论:呼吸内科鲍曼不动杆菌主要携带blaOXA-23和adeB主动外排泵基因,可能与亚胺培南耐药密切相关。

改良碱裂解法和煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA效果的比较

目的:建立一种简便经济的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法。方法:选取10株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,预先以终浓度2 mg/mL溶菌酶处理6 h,再以改良碱裂解法提取细菌基因组DNA。同时以常规煮沸法制备上述细菌基因组DNA。采用PCR法扩增两种模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,比较两种方法提取DNA的效果。结果:以改良碱裂解法制备DNA为模板,所有10株标本均可扩增出spa基因和mecA基因,4个标本扩增出femB基因;以直接煮沸法制备DNA为模板,仅1个标本扩增出spa基因,2个标本扩增出mecA基因,所有标本未扩增出femB基因。结论:改良碱裂解法提取基因组DNA效果优于直接煮沸法,所提取基因组DNA可以满足PCR扩增的要求。