西方蜜蜂AKHR基因的生物信息学及表达模式分析

本研究对西方蜜蜂Apis mellifera脂动激素受体(Adipokinetic hormone receptor,AKHR)基因AmAKHR CDS区进行RT-PCR扩增和生物信息学分析,并测定了AmAKHR在工蜂不同组织和不同发育阶段的表达模式,旨在为进一步的功能研究提供参考和基础。通过PCR扩增AmAKHR的CDS,使用相关软件预测AmAKHR蛋白的理化性质、分子特征及蛋白互作网络。采用RT-qPCR技术检测AmAKHR在工蜂不同组织和不同发育阶段的相对表达量。结果表明,AmAKHR基因CDS长度为1050 bp,编码349个氨基酸;AmAKHR的相对分子量约为40.63 kDa,分子式为C1873H2939N471O484S26,含39个磷酸化位点,7个α-跨膜螺旋结构及8个保守基序,不含信号肽,主要分布于质膜;AmAKHR与小蜜蜂Apis florea的AKHR在进化树上聚为一支;AmAKHR的二级结构包含127个无规则卷曲,124个α-螺旋,87条延伸链和11个β-转角;AmAKHR与卵黄原蛋白和神经肽Corazonin等10个蛋白构成1个互作网络;AmAKHR在西方蜜蜂工蜂的毒腺、中肠、咽下腺、脂肪体、脑和触角等6个组织中差异表达,在脂肪体中的表达量最高,而在中肠中的表达量最低;AmAKHR在西方蜜蜂工蜂1日龄幼虫、3日龄幼虫、5日龄幼虫、2日龄预蛹、1日龄蛹中均有表达,且表达量随着日龄的增长而持续上调。研究结果揭示AmAKHR为疏水性蛋白和膜蛋白,并与卵黄原蛋白和神经肽等10个蛋白潜在互作,AmAKHR可能在西方蜜蜂工蜂的能量代谢、脂类分解和变态发育中发挥作用。

基于RGB模型的草莓叶片光合作用指标估测

为了研究基于图像红(R)、绿(G)、蓝(B)颜色参数和叶片SPAD值预测光合作用指标的可行性,以草莓叶片为试验材料,构建多元线性回归模型和反向传播(BP)神经网络模型,对叶片蒸腾速率、气孔导度、净光合速率、胞间CO_(2)浓度进行估测,并对其精度进行评价和验证。结果表明,基于BP神经网络模型,使用图像RGB颜色参数和SPAD值对叶片蒸腾速率进行预测的效果较好,其次是气孔导度。BP神经网络模型的估测精度高于多元线性回归模型,蒸腾速率、气孔导度、净光合速率和胞间CO_(2)浓度的模型预测准确率分别达到91.5%、83.3%、74.4%和71.5%。BP神经网络的蒸腾速率模型、气孔导度模型的决定系数(R2)分别为0.9222、0.8423,均方根误差(RMSE)分别为0.0002、0.0259,平均绝对误差(MAE)分别为0.0001、0.0006。由结果可知,通过数码相机采集图像,并构建RGB模型,可简易快速估测草莓叶片蒸腾速率、气孔导度,能用于生产中草莓光合指标的估测。

利用中华蜜蜂工蜂幼虫肠道转录组纳米孔长读段数据完善东方蜜蜂参考基因组序列和功能注释

【目的】将已获得的中华蜜蜂Apis cerana cerana转录组纳米孔长读段数据比对到东方蜜蜂A.cerana参考基因组,进行注释基因的结构优化,鉴定未注释的新基因和新转录本并进行功能注释以及预测其SSR位点、完整ORF和转录因子(transcription factor,TF)家族及成员的分析验证,完善现有的东方蜜蜂参考基因组序列和功能注释。【方法】基于已获得的高质量的接种蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis的中华蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道转录组纳米孔测序数据,使用gffcompare软件将已鉴定到的全长转录本比对到东方蜜蜂参考基因组以优化已注释基因的结构;采用gffcompare软件鉴定参考基因组上未注释的新基因和新转录本,再通过比对Nr,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库进行功能注释;使用MISA,TransDecoder v3.0.0和animalTFDB 2.0软件分别预测SSR位点、完整ORF和TF家族及成员。【结果】共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的4648个基因结构进行了优化,对1336个基因同时延长了5′UTR和3′UTR,分别延长了1688个基因的5′UTR和1624个基因的3′UTR;共鉴定到2148个新基因,其中分别有818,298,587,359和333个新基因可注释到Nr,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库;共鉴定到35432条新转录本,其中分别有30974,21222,29025,19852和9214条新转录本可注释到上述5个数据库;共发掘出22541个SSR位点,其中单、双、三和六碱基重复的SSR数量分别为12078,7140,2825和43个,混合SSR的数量为2964个,分布频率最高的类型是单碱基重复(153.37个/Mb);共预测到58个TF家族及1611个成员;共预测出28775个完整ORF,其中编码长度分布在100~200个氨基酸的ORF(38.99%)最多。【结论】研究结果优化了东方蜜蜂参考基因组上已注释基因的结构,并补充了参考基因组上未注释的新基因、新转录本、SSR、完整ORF及TF。

中华蜜蜂工蜂幼虫肠道全长转录组构建与注释

【目的】通过纳米孔(nanopore)测序技术组装和注释中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道高质量全长转录组。【方法】采用Nanopore PromethION系统对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis接种的中华蜜蜂工蜂3日龄幼虫后的4, 5和6日龄幼虫肠道(分别为AcT4, AcT5和AcT6)进行转录组测序,鉴定全长转录本序列;将前期未接种蜜蜂球囊菌中华蜜蜂工蜂4, 5和6日龄幼虫肠道转录组纳米孔测序数据中鉴定到的全长转录本与上述鉴定到的全长转录本混合后滤除冗余全长转录本;将鉴定到的非冗余全长转录本比对Nr, KOG, eggNOG和GO数据库进行注释。采用CPC, CNCI, CPAT和Pfam 4种方法预测长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)。【结果】AcT4, AcT5和AcT6分别测得14 474 634, 10 461 827和11 890 978条原始读段(raw reads),分别包含11 898 582, 8 630 186和9 091 035条全长转录本,去冗余后分别鉴定到27 815, 21 781和20 004条非冗余全长转录本,N50长度分别为1 900, 1 961和2 294 bp,平均长度分别为1 534, 1 584和1 792 bp,最长读段长度分别为10 855, 10 837和10 887 bp。鉴定到40 562条去非冗余全长转录本,分别有35 415, 24 646, 34 054和23 053条转录本可分别注释到Nr, KOG, eggNOG和GO数据库。在Nr数据库中注释全长转录本数目和占比最高的物种是东方蜜蜂A.cerana(20 310条,57.35%),其次为西方蜜蜂A.mellifera(4 686条转录本,占13.23%)、大蜜蜂A.dorsata(2 536条转录本,占7.16%)和小蜜蜂A.florea(2 079条转录本,占5.87%)。非冗余全长转录本可注释到eggNOG数据库中的未知功能及翻译后修饰、蛋白质更新和分子伴侣等25个功能分类、KOG数据库中的仅一般功能预测和信号转导机制等25个功能分类、GO数据库中生物学进程、细胞组分和分子功能三大类中的50个功能条目以及KEGG数据库中核糖体和RNA转运等196条通路。共鉴定到2 301条高可信度lncRNA,涉及正义链lncRNA、反义链lncRNA、内含子lncRNA和基因间区lncRNA 4种类型。【结论】成功构建和注释了中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的首个全长转录组,为中华蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana其他亚种的分子生物学及组学研究提供了高质量参考背景和关键基础。

老年急性脑梗死患者血清Hcy、IMA水平与神经功能缺损程度和预后的关系

目的:探讨老年急性脑梗死(ACI)患者血清同型半胱氨酸(Hcy)、缺血修饰蛋白(IMA)水平与神经功能缺损程度和预后的关系。方法:选取207例老年ACI患者为研究对象,根据美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分分为神经缺损轻度组(NIHSS<4分,n=59)、中度组(NIHSS=4~15分,n=96)及重度组(NIHSS>15分,n=52);根据患者治疗1个月后改良Rankin量表(mRs)评分分为预后良好组(mRs≤2分,n=160)及预后不良组(mRs>2分,n=47)。比较不同程度神经缺损及不同预后患者血清Hcy、IMA水平,分析其与神经缺损程度的相关性及对ACI患者预后不良的预测诊断价值。结果:不同程度神经缺损组患者血清Hcy、IMA水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),且重度组>中度组>轻度组。预后良好组患者血清Hcy、IMA水平低于预后不良组(P<0.05)。相关性分析显示,血清Hcy、IMA水平与老年ACI神经功能缺损程度呈正相关关系(r=0.326、0.513,P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清Hcy(AUC=0.711)及IMA(AUC=0.829)对老年ACI患者预后不良均有良好的预测诊断价值,且两者联合检测的诊断效能更佳(AUC=0.861)。结论:血清Hcy、IMA水平不仅能反应老年ACI患者的神经缺损程度,还有助于评估近期预后状况。

短暂性脑缺血发作患者血清Lp-PLA2、MCP-1水平与认知功能的关系

目的:探究短暂性脑缺血发作(TIA)患者血清脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)水平与认知功能的关系。方法:选取126例TIA患者为观察组,对患者进行MMSE评分;并选取同期体检的126名健康者为对照组。对比各组Lp-PLA2、MCP-1水平,并评价其对TIA患者认知功能损伤的预测价值。结果:认知功能障碍程度越严重,Lp-PLA2与MCP-1水平越高,MMSE评分越低(P<0.05);TIA组患者Lp-PLA2、MCP-1水平均与MMSE评分负相关(P<0.05);Lp-PLA2与MCP-1的最佳截断值分别为218.73、120.52 ng/mL,联合诊断的AUC为0.795,均高于单独诊断的0.677、0.651,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TIA患者血清MCP-1、Lp-PLA2水平升高,MMSE评分降低,血清MCP-1、Lp-PLA2水平与认知功能损伤程度可能有关。

意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本鉴定及验证

【目的】利用前期获得的高质量纳米孔长读段测序数据对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本进行鉴定和分析,为深入开展功能研究提供参考信息和基础。【方法】基于前期获得的高质量意大利蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将意大利蜜蜂全长转录本比对Nr数据库筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本;利用gffcompare软件将筛选出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶全长转录本与西方蜜蜂A.mellifera参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较,以鉴定未注释的新基因和新转录本;使用Astalavista软件鉴定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的可变剪接(alternative splicing,AS)事件类型,采用IGV浏览器对剪接体的结构进行可视化,通过RT-PCR验证随机选取的6次AS事件的真实性。【结果】共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶71个基因和335条全长转录本,发掘出未注释的1个新基因和97条新转录本;共对14个已注释基因进行了结构优化,分别延伸了6个基因的5′端和8个基因的3′端。共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶7个基因的57次AS事件,包括40次外显子跳跃(exon skipping,ES)事件、15次可变5′端剪接位点(alternative 5′splicing site,A5SS)事件和2次可变3′端剪接位点(alternative 3′splicing site,A3SS)事件。对随机选取的6次AS事件的RT-PCR结果表明,所有目的片段均符合预期大小,证实了AS事件的真实性。【结论】本研究系统鉴定了意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本,优化了西方蜜蜂参考基因组注释的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因结构。

肿瘤细胞外泌体的生物学功能及其检测方法研究进展

外泌体是一类细胞分泌的微小囊泡,其中包含蛋白质、脂质和核酸等重要的生物活性物质。外泌体作为细胞间通讯的重要载体,直接参与机体内肿瘤的发生、发展进程,通过影响肿瘤微环境,进而介导肿瘤细胞的生长和迁移。由于外泌体具有特殊的生理功能,近年来,将其作为重大疾病治疗载体和生物标志物的研究日益增加,针对外泌体的检测方法也得到不断发展。对肿瘤细胞外泌体的生物学功能和检测的近期相关研究进行系统综述,并对检测方法的发展趋势加以展望。

睡眠时长变短对经皮冠状动脉介入治疗后发生再次血运重建事件的影响

目的评估睡眠时长变短对行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)冠心病患者术后发生再次血运重建事件的影响。方法连续纳入中国医学科学院阜外医院冠心病中心16948例接受PCI的注册登记患者,根据术后随访患者睡眠时长的变化分为睡眠时长较术前减少,即睡眠时长变短组(1826例),其余患者为对照组(15122例),主要研究终点为再次血运重建事件,通过多因素Cox回归探讨睡眠时长变短与再次血运重建事件的关系。结果患者平均随访时间为(3.0±1.6)年,共1563例(9.2%)患者发生再次血运重建,其中睡眠时长变短组216例(11.8%),对照组1347例(8.9%),差异有统计学意义(P<0.001)。校正混杂因素后,与对照组相比,睡眠时长变短组患者发生再次血运重建事件的风险显著升高(HR 1.407,95%CI 1.217~1.627,P<0.001)。考虑死亡事件的竞争风险模型结果相似,显示睡眠时长变短组患者发生再次血运重建事件的风险更高(HR 1.404,95%CI 1.215~1.622,P<0.001)。对年龄、性别进行亚组分析,在高龄、低龄、男性、女性亚组人群中,与对照组相比,睡眠时长变短组患者发生再次血运重建事件的风险升高。结论行PCI的冠心病患者术后睡眠时长变短与高再次血运重建发生风险有关。

西方蜜蜂几丁质合成酶基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】本研究旨在明确西方蜜蜂Apis mellifera几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)基因的分子特性,并揭示CHS在西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis胁迫的免疫应答中的功能。【方法】利用相关生物信息学软件预测和分析西方蜜蜂CHS蛋白的分子特性、保守基序和结构域。使用MEGA X软件对西方蜜蜂和其他昆虫CHSs的氨基酸序列进行系统进化分析。采用体外转录法合成CHS和egfp的dsRNA,饲喂蜜蜂球囊菌胁迫的西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫以进行RNAi,并利用RT-qPCR检测西方蜜蜂工蜂5日龄幼虫肠道中CHS及宿主响应蜜蜂球囊菌侵染的免疫相关基因abaecin,apidaecin,birc5,defensin-1和PGRP-S2的表达量。【结果】西方蜜蜂CHS蛋白含有1572个氨基酸,属于20种氨基酸,其中正电荷氨基酸与负电荷氨基酸分别为177和169个,分子量约为178.77 kD,等电点为6.65;含纤维素合酶CESA3催化结构域。在西方蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana等共13种昆虫的CHSs中均鉴定到3个Motif(Motif 1,Motif 2和Motif 3)和2个结构域(Chitin_synth_2和Glyco_trans_2_3)。系统进化树表明,膜翅目的西方蜜蜂与东方蜜蜂的CHSs的氨基酸序列一致性最高,聚为一支且自举值为100。相较于ds egfp饲喂对照组,ds CHS饲喂组5日龄幼虫肠道中CHS的表达量显著下调,干扰效率为29.40%,abaecin,birc5和defensin-1的表达量均极显著上调,PGRP-S2的表达量显著上调,apidaecin的表达量极显著下调。【结论】西方蜜蜂CHS可能是胞内亲水性跨膜蛋白,西方蜜蜂与其他昆虫CHSs的氨基酸序列具有较高的保守性,其中与东方蜜蜂的CHS的氨基酸序列之间保守性最高,CHS影响西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。

急性心肌梗死患者溶栓后出血预测因素分析

目的:了解急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者接受溶栓治疗后的出血发生率,并探讨出血相关的预测因素。方法:2013-01至2014-06纳入中国急性心肌梗死(CAMI)注册研究中1 568例行溶栓治疗的急性STEMI患者,了解其溶栓后出血发生率,并根据出血情况,分为出血组(n=55)和未出血组(n=1 513),同时利用Logistic多元回归模型分析出血相关因素。结果:1 568例急性STEMI患者溶栓后,临床判断溶栓成功率为86%,出血发生率为3.5%,其中脑出血发生率为0.6%,消化道出血为1.9%。与未出血组相比,出血组溶栓成功率高,趋近统计学差异(94.1%vs 85.7%,P=0.0589),死亡率明显较高(20.0%vs 7.1%,P=0.0019)。Logistic多元回归分析显示,高龄(≥75岁)(OR=2.45,95%CI:1.10～5.46,P=0.0290),和使用重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)(OR=3.41,95%CI:1.48～7.86,P=0.0040)是院内溶栓出血的独立预测因素。结论:中国急性STEMI患者溶栓合并出血事件率较低,高龄与使用rtPA是出血的独立预测因素。

不同LED光照对番茄果实品质和糖类物质含量的影响

采用发光二极管(LED)调制光源,在白光背景下添加不同的光照,以白光为对照,研究不同光照下矮化番茄果实产量、果实品质和糖类物质含量的变化,旨在探明不同LED光照对番茄果实产量和品质的影响。结果表明,在白光背景下添加红光、蓝光和红蓝组合光后,番茄结果时间显著提前。番茄果实横径和纵径在不同光照处理间无显著性差异。白光对照单果质量最大,白光+红光+蓝光处理果实数量最多。白光+红光+蓝光处理果实中可溶性固形物、糖酸比和番茄红素含量均最高,与白光对照相比分别提高19.68%、43.80%和42.49%。白光对照果实维生素C含量最高。由此可见,红光和蓝光是影响番茄果实品质的主要光照。

PARIS出血评分对急性心肌梗死药物支架术后患者院内出血的预测价值--中国急性心肌梗死注册研究

目的:评估支架术后抗血小板药物停药模式(PARIS)出血评分对我国使用药物洗脱支架(DES)并应用双联抗血小板治疗(DAPT)的急性心肌梗死(AMI)患者住院期间出血的预测价值。方法:中国急性心肌梗死(CAMI)注册研究在2013-01-01至2014-09-30期间107家医院连续入选了27 594例AMI患者,其中14 625例在住院期间成功置入DES并接受DAPT,分别采用出血学术研究联合会(BARC)3型和5型及BARC 2型、3型和5型做为出血的终点事件,评价我国置入DES术后接受DAPT的AMI患者住院期间出血发生情况、临床特征和PARIS出血评分对这两种出血终点事件的预测价值。结果:出血患者的PARIS评分明显高于无出血患者(P<0.001)。按照PARIS评分的危险分层,以BARC 3型和5型为出血终点时,共有77例(0.53%)患者出现出血事件,高危、中危、低危患者之间的PARIS评分差异有统计学意义(P<0.001)。出血中危患者出血风险是低危患者的2.38倍(P=0.006);出血高危患者出血风险是低危患者的4.78倍(P<0.001)。以BARC 2型、3型和5型为出血终点,共有223例(1.52%)出现出血事件。出血中危患者出血风险是低危患者的1.64倍(P=0.002);出血高危患者出血风险是低危患者的2.23倍(P=0.001)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示,PARIS出血评分对以BARC 3型和5型或BARC 2型、3型和5型为出血事件终点均有预测价值。对以BARC 3型和5型为终点的预测价值[曲线下面积(AUC):0.672]高于以BARC 2型、3型和5型为出血事件终点的预测价值(AUC:0.596;z=2.079,P=0.038),即PARIS出血评分对严重出血的预测价值更优。结论:PARIS出血评分对置入DES并接受DAPT的AMI患者住院期间出血具有预测价值,并可用于危险分层。PARIS出血评分对严重出血作为终点事件的预测价值更优。

不同光质处理对樱桃番茄生长发育和叶绿素荧光的影响

【目的】探索红蓝LED光源在番茄设施栽培生产上的精准化应用,为番茄苗高品质栽培提供理论依据。【方法】以樱桃番茄千禧为材料,设置6个不同光处理:对照白光(CK)、红/蓝=1∶1(1R1B)、红/蓝=7∶3(7R3B)、红/蓝=3∶7(3R7B)、单红光(R)和单蓝光(B)。于3叶1心期开始进行光照处理,研究不同光处理30 d后对樱桃番茄生长的影响。测定不同光处理下番茄植株生长状态指标(干鲜重、壮苗指数、根冠比)、叶片光合色素含量、叶绿素荧光参数、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量变化。【结果】LED光处理下番茄植株鲜重均高于对照,其中7R3B最高,比对照增加了50.5%,其次为1R1B处理比对照增加了31.3%;番茄植株干重在1R1B下最高,比对照(1.11 g)增加了61.0%;壮苗指数在1R1B下数值最高,显著高于对照及其他处理。研究还发现3个红蓝组合光下的植株壮苗指数均高于对照,而两个单色光处理下的壮苗指数均低于对照。使用LED光照处理后,单色红光处理对番茄叶片中叶绿素含量有抑制作用,其他光处理下叶绿素a和叶绿素b的含量都有所上升。POD活性随着处理中红光比例的增加而提高,蓝光会降低POD活性;SOD活性在6个光处理下没有显著性差异;MOD活性在1R1B下数值最高,在红光下数值最低。【结论】红蓝1∶1组合光下植株生长健壮,番茄植株的干物质积累量大,光合效率较高,可以作为人工栽培光源的有效参数。

基于互联网平台的微健康教育模式在血脂异常患者中的应用

目的探讨基于互联网平台的血脂异常患者微健康教育干预效果。方法采用整群随机抽样的方法 ,抽取2016年6—12月在海南省某体检中心参加体检的海口市某两个事业单位18～45岁的中青年血脂异常患者各60例分别设为A干预组、B空白对照组。A组在B组传统健康教育方式的基础上开展为期6个月的以网络平台为基础的微健康教育干预实验,并对干预效果进行评价。结果 B组血脂异常者干预后的血脂达标率仅为20.18%,明显低于A组的46.54%,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者的护理服务满意度、BMI、血压、TC、LDL-C、HDL-C差异有统计学意义(P<0.05)。结论基于互联网平台的微健康教育的干预方法对中青年血脂异常患者是一种有效的防治措施。

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的比较转录组分析

为探究实验室条件下纯培养的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)菌丝(AaM)和孢子(AaM)的共有基因、特有基因以及差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)与真菌的生长、发育、生殖和致病性的相关性,利用RNA-seq技术和生物信息学方法对AaM和AaS进行比较转录组分析,并结合实时荧光定量PCR验证转录组数据的可靠性.分析结果显示AaM和AaS的共有基因为7362个,涉及44个功能条目和122条通路;二者的特有基因分别为195和278个.AaM vs AaS比较组含有977个上调基因和687个下调基因,分别涉及32和32个功能条目;此外,上述DEG还涉及糖酵解/糖异生、次级代谢物的生物合成等113条通路.基于比较转录组分析发现球囊菌菌丝和孢子的共有基因、特有基因和DEG可能通过调节细胞活动、代谢进程、内吞作用以及MAPK信号通路等关键途径参与球囊菌的生长、发育和生殖过程.

参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠基因表达的东方蜜蜂微孢子虫miRNA的组学解析及其调控网络

【目的】本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)靶向意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的mRNA和差异表达mRNA(differentially expressed mRNA,DEmRNA)进行生物信息学预测、数据库注释和调控网络分析,旨在解析东方蜜蜂微孢子虫对意大利蜜蜂工蜂中肠的基因表达调控。【方法】比较东方蜜蜂微孢子虫感染7 d(AmT1)和10 d(AmT2)的意大利蜜蜂工蜂中肠和未感染中肠(分别为AmCK1和AmCK2)的mRNA数据,筛选意大利蜜蜂工蜂的显著性DEmRNA;通过比较侵染AmT1和AmT2的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子(NcCK)的miRNA数据筛选出东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA。利用TargetFinder软件预测东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中肠DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述意大利蜜蜂工蜂中肠靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。根据KEGG数据库注释信息筛选出意大利蜜蜂工蜂中肠免疫防御和能量代谢通路相关DEmRNA,并构建和分析上述DEmRNA与相应的东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA之间的调控网络。【结果】NcCK vs NcT1比较组中东方蜜蜂微孢子虫的77条显著上调miRNA和52条显著下调miRNA可分别靶向AmCK1 vs AmT1比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的118条显著下调mRNA和135条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到31和25个GO条目,以及113和107条KEGG通路。NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的97条显著下调mRNA和210条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到27和30个GO条目以及97和127条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的11条共同显著上调miRNA和19条共同显著下调miRNA分别靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的6条共同显著下调和14条共同显著上调mRNA,可分别注释到7和10个GO条目以及0和9条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA可靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的氧化磷酸化和硫代谢等能量代谢通路相关DEmRNA,以及胞吞作用、黑色素生成、溶酶体、自噬、Toll样受体信号通路、细胞凋亡、Ras信号通路、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫防御通路相关DEmRNA。进一步分析发现,miR-216-x,miR-5119-y,bantam-y和miR-8-y在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中皆显著上调表达,且靶向意大利蜜蜂工蜂中肠的溶酶体、黑色素生成、泛素介导的蛋白水解、MAPK信号通路及Ras信号通路等免疫防御通路相关的显著下调mRNA。【结论】在侵染过程中,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA对意大利蜜蜂工蜂的基因表达具有广泛的潜在影响,东方蜜蜂微孢子虫可能通过上调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的免疫防御以促进侵染,通过下调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的能量代谢以加强能量窃取并促进增殖。

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中全长转录本的差异表达分析

【目的】本研究旨在探究蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称“球囊菌”)菌丝(Aam)和孢子(Aas)中的全长转录本与菌丝生长、孢子萌发以及有性生殖的相关性。【方法】将前期获得的Aam和Aas的Nanopore长读段测序数据中的有效读段与球囊菌参考基因组注释的已知转录本进行序列比对,获取全长转录本与已知转录本的对应信息。利用生物信息学方法对Aam和Aas的全长转录本进行差异表达、功能注释以及结构特征分析。【结果】Aam和Aas共有的全长转录本数量为19966条,特有的全长转录本数量分别为1273和2856条。Aas vs Aam比较组含有3230条差异表达转录本(differentially expressed transcripts,DETs),包含3072条上调和158条下调。GO功能注释结果显示,这些DETs涉及代谢进程、细胞、催化活性等GO条目。KEGG注释结果显示,这些DETs注释到内吞作用、MAPK信号通路、糖酵解/糖异生、碳代谢以及氨基酸的生物合成等相关通路。进一步分析发现,部分全长转录本的剪接异构体在Aam和Aas中具有不同的表达量和结构。【结论】本研究发现球囊菌在菌丝和孢子两个不同阶段伴随着转录本表达量和结构的变化,研究结果为深入探究不同剪接异构体在球囊菌的菌丝生长、孢子萌发和有性生殖中的分子功能提供了理论依据和数据基础。

基于液相色谱-质谱联用技术的蛋白质类肿瘤标志物定量方法研究进展

液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术因具有高通量、高灵敏度等优点而成为发现、验证生物标志物及对生物标志物进行定量分析的有力工具。近年来,LC-MS在临床应用中,特别是在定量肿瘤生物标志物方面做出了重要贡献。研究人员通过不同的设计原理开发出多种定量方法,逐步实现了对高度复杂样品中蛋白质类肿瘤标志物的准确定量。本文从用于定量蛋白质类肿瘤标志物的样品前处理方法及LC-MS分析中的质谱扫描策略两个方面,对近年来的主要定量方法进行总结。

基于第三代纳米孔测序技术的东方蜜蜂微孢子虫全长转录组构建及注释

【目的】本研究旨在利用Oxford Nanopore测序技术组装和注释东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的高质量全长转录组。【方法】采用Nanopore PromethION系统对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子进行转录组测序。通过识别每条clean read两端引物鉴定全长转录本序列。利用Blast工具将全长转录本比对Nr,Swiss-Prot,KOG,eggNOG,Pfam,GO和KEGG数据库,获得相应注释信息。分别利用蛋白结构域分析方法CPC,CNCI,CPAT和Pfam对长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)进行预测,获得高可信度lncRNA。利用CPM(counts per million)法计算每一条全长转录本的表达量。【结果】利用Nanopore PromethION系统对东方蜜蜂微孢子虫转录组测序共测得6988795条raw reads,经质控获得6953469条clean reads,其中包含5143999条全长转录本。共鉴定到10243条非冗余全长转录本,N50和平均读长分别为1042 bp和894 bp,最大读长为4855 bp。有9342,4038,4283,2569,4859和3450条全长转录本分别注释到Nr,KOG,eggNOG,Pfam,GO和KEGG数据库。注释到东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫Nosema apis和家蚕微孢子虫Nosema bombycis的全长转录本数量最多。共鉴定到87条高可信度lncRNA,包含49条正义链lncRNA(sense lncRNA)、25条反义链lncRNA(anti-sense lncRNA)和13条基因间区lncRNA。本研究的测序量足以检测到全部表达的全长转录本,全长转录本的表达量(CPM)范围在0.1到10000以上。【结论】本研究构建和注释了东方蜜蜂微孢子虫的高质量全长转录组数据,可为病原的比较转录组分析、转录本的可变剪接和可变腺苷酸化分析、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)位点挖掘、基因结构优化以及基因全长序列克隆及功能研究提供关键基础。