养殖池形对子二代中华鲟生长、呼吸代谢及血清生理的影响

为掌握循环水养殖模式下适宜子二代中华鲟(Acipenser sinensis)生长的养殖池形,分析了养殖池形对子二代中华鲟生长及血清生理的影响。以平均体质量(2.43±0.19)kg,平均体长(63.77±2.15)cm的子二代中华鲟为试验对象,设计了圆形(YX)、跑道形(PX)和方切角形(FX)3种养殖池形,试验周期为90 d。结果显示:养殖池形对子二代中华鲟的生长影响显著,FX组的中华鲟特定生长率和增重率显著低于YX组和PX组(P<0.05),而饲料系数显著高于其他两组(P<0.05);中华鲟的存活率受养殖池形的影响,FX组的中华鲟存活率低于其他两组;血清生化指标表明,FX组中的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)显著低于其他两组,其他血清生化指标无显著差异(P>0.05);另外,FX组的耗氧率显著高于PX组(P<0.05),而排氨率无显著差异(P>0.05)。研究表明,在循环水养殖系统中设计养殖池时,圆形或跑道形是适宜中华鲟健康生长的鱼池形状。

黄颡鱼腹水征病原菌的分离与鉴定

黄颡鱼腹水征因其流行范围广、传染性强、死亡率高的特点,已严重威胁黄颡鱼养殖业的健康发展。本研究从患典型腹水征的黄颡鱼肝脏中分离得到一株细菌XJH01,经菌体形态观察、回归感染试验、生化鉴定和16S rDNA序列分析,确定该病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),其半数致死剂量为(2. 27±0. 33)×10~6CFU/m L。患病鱼体腹部膨大,腹腔内含有大量积水。经组织病理学观察发现,患病鱼的鳃结构崩解,脾、肾组织及肠上皮细胞坏死。药物敏感试验结果表明,病原菌XJH01对哌啦西林、克拉霉素、恩诺沙星、氟苯尼考等8种抗生素高度敏感,对麦迪霉素、氨苄西林、大观霉素、万古霉素等8种抗生素中度敏感,对苯唑西林、阿米卡星、链霉素等3种抗生素不敏感。本研究为黄颡鱼腹水征的诊断与防治技术研究提供参考。

池塘养殖患病黄颡鱼病毒病原的电镜观察初报

应用电子显微镜技术,对池塘养殖下颌出血的患病黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco内脏组织进行超薄切片电镜观察。在患病黄颡鱼的脾脏和肾脏组织中观察到大量球形无囊膜病毒样颗粒,直径约30~40 nm;病毒粒子分布在宿主细胞的细胞质中,有的由单位膜包裹在包涵体中,而正常黄颡鱼组织中未观察到球形样病毒颗粒。

罗非鱼肾脏细胞系的建立及其生物学特性

采用组织块移植法,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肾脏组织细胞进行原代培养,建立了罗非鱼肾脏细胞系,已稳定传代培养50代以上,命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞,其最佳培养基为DMEM,最适培养温度为28℃,最适血清浓度为15%。在最适培养条件下,罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏,经台盼蓝染色,约(89.84±3.48)%的细胞具有活性,复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示,第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20～66之间,众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞,可产生典型的细胞病变效应,表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。

鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus,CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg2+浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L,Betaine 0.7 mol/L,Mg2+8.0 mmol/L,dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍;CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。

鳜脑组织细胞系的建立及其病毒敏感性研究

鱼类细胞是开展鱼类病毒分离鉴定、功能基因分析以及生物制品制备等研究的重要物质基础。鳜(Siniperca chuatsi)是深受养殖者和消费者欢迎的养殖品种。随着鳜鱼养殖产量的逐年增加,其病害问题尤其是病毒病问题也日趋严重,但是,可用于鳜鱼病毒分离和基因功能分析的鳜细胞系缺乏。本研究采用组织块消化法,对来源鳜脑组织的细胞进行原代培养,建立了鳜脑组织细胞系,命名为MFB。MFB细胞在28℃含10%胎牛血清的L-15中已稳定传代超过70次,第25代鳜脑组织细胞的染色体众数为56。采用免疫荧光细胞化学技术(β-tubulin和Neu-N)鉴定MFB细胞的神经元纯度,结果显示,培养的MFB细胞为神经元类细胞。病毒敏感性实验结果显示,鳜蛙虹彩病毒(MFRaIV)、大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBRaIV)和大鲵虹彩病毒(GSIV)均可在MFB细胞中产生典型细胞病变效应,病毒滴度分别为10^(8.68±0.12)、10^(8.36±0.15)、10^(10.15±1.85)TCID_(50)/mL。使用脂质体Lipofectamine^(■)2000将pEGFP-N1转入MFB细胞,转染效率可达20%。本研究建立的鳜脑组织细胞系不仅对多种蛙虹彩病毒敏感,而且转染质粒效率较高,为鳜病毒性病原的分离及基因功能研究奠定了前期基础。

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考。本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析。结果从患病中华鳖体内分离纯化得到一株致病菌,命名为AM-1,经鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);用该菌进行人工感染得到的症状与自然发病中华鳖症状一致;该菌对恩诺沙星和左氧氟沙星等药物敏感,对复方新诺明、氨苄西林和四环素等不敏感。毒力基因检测显示,该嗜水气单胞菌AM-1分离株携带气溶素、热不稳定性肠毒素、热稳定性肠毒素、溶血素、弹性蛋白酶5种毒力基因。最终表明嗜水气单胞菌AM-1是引起此次中华鳖发病的病原,可以使用恩诺沙星和左氧氟沙星等药物进行防治。

不同测定方法对聚维酮碘杀菌效果的比较研究

以6株黄鳝源嗜水气单胞菌分离株作为受试菌,研究聚维酮碘在两种测定方法下的杀菌率、有效碘含量,及其对黄鳝的急性毒性,评价不同测定方法的准确性及应用安全性。试验结果显示,采用试管二倍稀释法,在溶菌肉汤、营养肉汤和双倍浓度营养肉汤培养基中,聚维酮碘对6株菌的24h最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为24g/L(溶菌肉汤=营养肉汤≥双倍浓度营养肉汤)。采用直接作用法时,5mg/L和10mg/L聚维酮碘在10min内的杀菌率分别为99.99%、100%。试管二倍稀释法中有效碘的含量(溶菌肉汤>营养肉汤>双倍浓度营养肉汤)也远低于直接作用法,且有效碘含量在24h后均下降。聚维酮碘对黄鳝的24h半致死质量浓度为173.91mg/L,这一质量浓度远高于直接作用法测定的有效杀菌质量浓度。试验结果表明,聚维酮碘对嗜水气单胞菌具有良好的杀灭性,且在黄鳝养殖中可安全使用。但其有效性易受有机物影响,故在水产养殖中推荐使用直接作用法来测定其有效杀菌质量浓度。

黄鳝atrogin-1蛋白表达及细胞定位研究

为提高黄鳝养殖效率以及肌肉的质量,进一步发掘黄鳝肌肉发育相关基因,以atrogin-1为研究对象,构建了3种原核表达载体:pCold-TF-atrogin-1、pET28a(+)-atrogin-1及pGEX6P-1-atrogin-1。将构建的重组表达载体转入Transetta(DE3)感受态细胞,重组菌株经诱导表达后,仅pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株表达出可溶性较高的重组蛋白。IPTG诱导试验结果表明,诱导剂浓度对蛋白质表达可溶性及含量几乎没有影响,诱导时间在20 h最佳。可溶性部分经Ni-NTA柱亲和层析纯化以及SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺)电泳,证实获得了重组蛋白。构建真核表达载体pEGFP-N1-atrogin-1,转染293T细胞,结果表明,atrogin-1融合蛋白在细胞质及细胞核中均有表达,且在细胞核中表达量相对较高。

Histopathology and Ultrastructural Pathology of Cyprinid Herpesvirus Ⅱ(CyHV-2) Infection in Gibel Carp, Carassius auratus gibelio

Cyprinid herpesvirus II （CyHV-2） infection is identi- fied in cultured gibel carp, Carassius auratus gibelio, with high mortality in China in recent years. Histological pathology includes acute hepatocellular necrosis, splenic necrosis, kidney necrosis, hyperplasia of the secondary lamellae with focal necrosis. Acute necrotic myocarditis and granulocytes are prominent within the cardiac lumen in infected fish. In addition, necrosis is observed in the submucosa and mucosa epithelium of intestinal tract. Edemas are observed in renal glomerulus, submucosa and mucosa epithe- lium of intestinal tract, myocardial cells and neurons. Transmis- sion electron microscopy indicates the cytoplasmic inclusions in splenocytes, glomerulus cells and hematopoietic tissue cells of kidney, epithelial cells of gills and brain cells. The histopathology and ultrastructural pathology in CyHV-2 infected gibel carp are characterized with extensive necrosis and cytoplasmic inclusions in spleen, kidney, gill and brain, which suggests that CyHV-2 may mainly infect the spleen, kidney, gill and brain of fish.