色甘酸钠灌胃对葡聚糖硫酸钠诱导的BALB/c小鼠溃疡性结肠炎模型的影响

目的·通过使用肥大细胞膜稳定剂色甘酸钠(sodium cromoglycate,Crom)稳定肥大细胞来探究其在小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)造模过程中的作用。方法·将15只小鼠分为空白组(n=5)、模型组(n=5)和Crom组(n=5)共3组。空白组小鼠自由饮用双蒸水7 d;模型组小鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)溶液7 d,构建溃疡性结肠炎模型;Crom组小鼠在饮用3%DSS溶液的第3日(即造模中期)灌胃服用Crom溶液。比较空白组、模型组和Crom组小鼠的体质量改变和疾病活动指数(disease activity index,DAI)的变化,利用苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察小鼠肠组织的病理情况和肥大细胞数量,并利用流式细胞仪检测小鼠脾脏免疫细胞的浸润情况。3组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),进一步组间比较采用最小显著性差异法(least-significant difference,LSD)。结果·与空白组相比,模型组小鼠重度便血,肠道病理显示有大量炎症性浸润,体质量下降严重(P=0.005),DAI评分升高明显(P=0.001),结肠长度明显缩短(P=0.003),且甲苯胺蓝染色显示肠道中肥大细胞数量增多(P=0.000)。与模型组相比,Crom组小鼠的便血减少,结肠长度有所增加(P=0.013);且肠道病理显示,其炎症情况较模型组有所改善,肥大细胞数量较模型组减少(P=0.000)。结论·色甘酸钠灌胃可减轻小鼠溃疡性结肠炎炎症反应,间接表明肥大细胞参与了溃疡性结肠炎的发病。

RSV感染气液相界面培养人支气管上皮细胞模型的建立及其对HMGB1和pMLKL表达的影响

目的构建呼吸道合胞病毒(RSV)感染气液相界面(ALI)培养的人支气管上皮细胞(hBEC)模型,为深入研究呼吸道病毒致病机制提供更接近体内环境的细胞模型;通过分析RSV感染对高迁移率族蛋白1(HMGB1)和磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域(pMLKL)表达的影响,探讨RSV感染损伤支气管上皮的致病机制。方法将hBEC接种到Transwell膜上,进行液体浸没式培养,细胞汇合度达100%后转ALI培养,倒置显微镜观察细胞生长状态。细胞分化成熟后按照以下分组分别感染RSV病毒:6 h对照组,6 h感染复数(MOI)1.0组,6 h MOI 3.0组,24 h对照组,24 h MOI 1.0组,24 h MOI 3.0组。每组3个复孔。通过免疫荧光染色确认RSV感染效果和RSV感染对细胞核蛋白HMGB1和pMLKL表达的影响。结果经细胞扩展期液体浸没式培养4~10 d后,细胞汇合度达100%。转ALI培养约4周后,细胞条索状分布越来越清晰,且分泌肉眼可见的黏液,形成黏液层,将Transwell膜石蜡包埋切片,得到典型的假复层上皮HE染色结果。经抗RSV抗体免疫荧光染色确认,MOI为3.0感染24 h RSV病毒成功感染细胞;抗HMGB1和抗pMLKL免疫荧光双染色结果显示,该感染条件下,细胞核内出现粉色荧光[为蓝色4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和红色HMGB1荧光Merge结果],证实RSV感染后出现HMGB1核表达;而RSV感染前后均未见pMLKL表达。结论通过在Transwell膜上液体浸没式扩展培养和ALI分化培养,可获得分化良好的hBEC,且能较长时间维持其形态及功能,可为呼吸道病毒感染及其他常见呼吸道疾病研究提供更接近体内环境的细胞模型。在MOI 3.024 h条件下,RSV成功感染该细胞模型,并引起损伤相关分子蛋白HMGB1核表达。

MSCs线粒体转移对脑缺血后损伤修复的作用研究

目的探索骨髓基质细胞(MSCs)中线粒体转移在脑缺血后的损伤保护作用。方法采用小鼠骨髓MSCs分离与原代培养方法,培养MSCs并通过流式细胞仪进行鉴定;取出生后第0天(P0)SD幼鼠的皮层,进行原代神经元培养,并进行氧糖剥夺(OGD)处理,将含有线粒体的MSCs培养基(MCM)组和不含有线粒体的MSCs培养基(mdMCM)组与OGD神经元进行共培养,另以未经过OGD处理的神经元(Neuron组)和经过OGD处理的神经元(OGD组)作为对照;通过MitoTracker追踪线粒体,分析线粒体从MSCs向OGD神经元的转移情况;通过检测试剂盒对神经元内ATP含量和神经元活性进行分析;通过对线粒体膜电势检测,分析线粒体的功能;采用Western Blot分析线粒体Miro1蛋白的表达水平;通过MCAO造模和计算梗死体积,分析MSCs移植对脑缺血的保护作用。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果原代培养的骨髓MSCs纯度达到99%以上。取原代培养MSCs的培养基分别去除线粒体(mdMCM)与不去除线粒体(MCM),与OGD神经元共培养,在MCM组,观察到神经元中存在MSCs来源的线粒体;经过OGD处理的神经元,其胞内ATP水平降低至0.634±0.023,给予MCM处理后,神经元胞内ATP水平上升至1.623±0.039,当给予mdMCM处理后,神经元胞内ATP水平降低至0.645±0.011,ATP比率变化的差异具有统计学意义(F=3413.62,P <0.01);经过OGD处理,神经元活性降低至(73.7±1.12)%;给予MCM处理后,神经元活升高到(83.3±1.57)%,当给予mdMCM处理后,神经元活性降低至(72.9±1.25)%,与MCM组相比差异具有统计学意义(F=654.280,P <0.01)。在未经过处理的对照组中,线粒体膜电势丢失1.7%;经过OGD处理后,膜电势丢失70.3%;添加MCM后的OGD神经元,线粒体膜电势丢失44.7%,与OGD组相比,差异具有统计学意义(P=0.036);而添加mdMCM的OGD处理神经元,线粒体膜电势丢失67.7%,与OGD+MCM组相比,差异具有统计学意义(P=0.041)。给予CCCP处理后的阳性对照神经元,膜电势丢失为99.3%。在Miro1表达干预中,空白对照组神经元胞内的ATP平均水平记为1,神经元活性为100%,计算其余各组相对空白对照组的ATP水平和神经元活性。在Miro1高表达组,胞内ATP水平为2.304,与对照质粒组(ratio=1.611)相比,差异具有统计学意义(P=0.034);神经元活性检测中,Miro1高表达组相比对照质粒组(90.4%vs 81.7%),差异具有统计学意义(P=0.040)。在MCAO手术后,小鼠的脑梗死体积达到38.4%,而给予MSCs后的小鼠,梗死面积降低到14.4%,差异具有统计学意义(P=0.004)。结论MSCs来源的线粒体可以向损伤神经元转移,提升神经元胞内ATP水平和神经元活性,降低缺血损伤中小鼠的脑梗死体积。线粒体Miro1蛋白参与了线粒体向神经元转移保护过程。

钙敏感受体抑制剂对创伤性颅脑损伤大鼠神经元凋亡的作用研究

目的 探索钙敏感受体抑制剂在创伤性颅脑损伤大鼠模型中对神经元凋亡的影响。方法 采用皮层定位精度撞击器进行大鼠的TBI造模;将大鼠随机分为对照组,TBI+溶剂组和TBI+钙敏感受体拮抗剂(NPS2390)组。通过mNSS对大鼠的神经功能进行评分;在TBI后24小时取脑,将全脑进行湿重与干重的称重,计算脑水肿程度;通过Western blot检测蛋白的表达水平。结果 TBI后溶剂组相比对照组,其脑水肿程度显著增加(80.03%vs 79.22%,P=0.018),神经功能评分显著下降(8.3vs 1.0,P=0.014),给予NPS2390后,可以降低TBI后脑水肿程度(79.38%vs 80.03%,P=0.029)及逆转神经功能评分下降(6.1vs 8.3,P=0.040)。TBI会导致神经元凋亡水平增加(55.3%vs 1.1%,P=0.006),cleaved caspase-3蛋白表达水平增加(2.71vs1.0,P=0.033),而NPS2390可以降低TBI神经元凋亡水平(30.2%vs 55.3%,P=0.031),相比TBI+溶剂组显著降低cleaved caspase-3的表达水平(1.52vs 2.71,P=0.041)。TBI还会降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(0.42vs1.0,P=0.035),增加促凋亡蛋白Bax的表达水平(1.89vs 1.0,P=0.021),增加细胞色素C的释放到胞浆的水平(2.89vs 1.0,P=0.019),给予NPS2390后,与TBI+溶剂组相比,Bcl-2表达增加(0.65vs 0.42,P=0.042),Bax表达水平增加(1.22vs 1.89,P=0.033),释放到胞浆中的细胞色素C降低(1.41vs 2.89,P=0.022)。结论 通过NPS2390抑制钙敏感受体可以减轻大鼠TBI后的神经元凋亡,对TBI起到保护作用。

Efficacy and mechanisms of Dingxian pill(定痫丸)combined with valproic acid on pentylenetetrazol-induced chronic epilepsy in rats

OBJECIVE:To investigate the efficacy and mechanisms of Dingxian pill(定痫丸)combined with valproic acid(VPA)on pentylenetetrazol-induced chronical epilepsy in rats.METHODS:A rat model of epilepsy was established by administering pentylenetetrazol(PTZ)water solution(35 mg/kg).Rats were divided into 4 groups,among which three groups were treated with different drugs once a day for 28 d including Dingxian pill(2.4 g/kg),VPA(0.2 g/kg),or a combination of Dingxian pill(2.4 g/kg)and VPA(0.2 g/kg)respectively,and the control group was given the same volume of saline.Rats in different groups were compared based on animal behavior,electroencephalograms,Morris water maze,immunohistochemistry,transcriptomics and real-time polymerase chain reaction.RSULTS:The combination therapy of Dingxian pill and VPA inhibited PTZ-induced seizure-like behavior and reduced seizure grades more significantly than VPA alone.Compared with the control group,the learning and memory ability of chronic PTZ-induced epileptic rats was improved in all the drug treatment groups,especially in the group that received both Dingxian pill and VPA.Similar to the results of MWM tests,expression of the neuroexcitability marker gene c-Fos was reduced after Dingxian pill and/or VPA treatment,and the effect was most pronounced in the combined treatment group.Transcriptomic analysis revealed that gene expression in the rodent hippocampus,which is involved in epilepsy,was upregulated by combined treatment with Dingxian pill and VPA,compared with VPA treatment alone.CONCLUSION:Our results not only highlight the antiepileptic effects of combined Dingxian pill and VPA treatment,but also shed light on the underlying molecular mechanisms and provide a way to apply Traditional Chinese Medicine in the treatment of epilepsy.