Dynamin 3在胃癌中的作用机制及预后价值

目的探讨Dynamin 3(DNM3)在胃癌中的作用机制及预后价值。方法采用生物信息分析、实验研究方法和回顾性队列研究方法。收集2013年1月至2018年7月福建医科大学附属协和医院收治的153例行根治性胃切除术胃癌患者的临床病理资料、新鲜胃癌及配对正常组织样本和石蜡切片,行实时荧光定量聚合酶链式反应检测、免疫印迹实验、流式细胞周期实验、免疫组织化学染色检测和预后分析。收集癌症基因组图谱(TCGA)数据库的胃腺癌(STAD)数据集进行生物信息分析。观察指标:(1)胃癌中DNM3基因在TCGA-STAD中的表达情况。(2)胃癌中DNM3的突变和拷贝数改变。(3)胃癌中DNM3的启动子甲基化水平。(4)胃癌中DNM3、p53的蛋白相对表达量。(5)胃癌中DNM3相关性和富集性分析。(6)流式细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期的比例。(7)胃癌中免疫细胞浸润和DNM3之间的相关性。(8)免疫组织化学染色检测与临床特征之间的相关性。(9)影响胃癌患者5年总生存率的独立因素分析。正态分布的计量资料以x±s表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD法;两组间比较采用t检验;偏态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示,组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以绝对数或百分比表示,组间比较采用χ^(2)检验或Fisher确切概率法。配对样本采用威尔科克森符号秩检验。等级资料采用秩和检验。运用Pearson相关系数或Spearman相关系数检验两组的相关性。单因素和多因素分析采用COX比例风险回归模型。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算生存率,采用Log-Rank检验进行生存情况分析。使用Benjamini-Hochberg错误发生率校正对P值进行调整。结果(1)胃癌中DNM3基因在TCGA-STAD中的表达情况。TCGA-STAD数据库中DNM3基因在27个肿瘤组织和配对正常组织中的表达水平分别为0.775(0.605,1.161)和1.216(0.772,1.681),两者比较,差异有统计学意义(Z=-2.64,P<0.05)。DNM3基因在笔者中心48对胃癌组织和配对正常组织中mRNA表达水平分别为4.370(2.870,6.040)和2.520(0.850,4.170),两者比较,差异有统计学意义(Z=-4.39,P<0.05)。(2)胃癌中DNM3的突变和拷贝数改变。TCGA-STAD数据库中16例胃癌患者发生DNM3突变或体细胞拷贝数改变,其中6个错义突变,1个截断突变,8个拷贝数增加,1个拷贝数减少。TCGA-STAD数据库370例胃癌患者中DNM3突变前后的mRNA表达水平分别为6.13(5.40,7.08)和5.02(3.98,5.46),两者比较,差异有统计学意义(Log2FC=-1.11,Z=-2.59,P<0.05)。(3)胃癌中DNM3的启动子甲基化水平。TCGA-STAD数据库中372例胃癌患者DNM3甲基化水平与DNM3 mRNA的检测结果显示:DNM3甲基化水平为0.198(-0.458,0.301),DNM3 mRNA表达水平为6.014(5.141,6.628),DNM3甲基化水平与DNM3 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.38,P<0.05)。32例患者随访结果显示:16例DNM3高甲基化组和16例DNM3低甲基化组患者3年总生存率分别为18.8%和41.3%,两者比较,差异有统计学意义(风险比=1.40,P<0.05)。免疫印迹实验结果显示:AGS细胞用0、0.5、1.0μmol/L 5-azacytidin处理后的DNM3相对表达量分别为0.270±0.020、0.357±0.051、0.599±0.039,3组比较,差异有统计学意义(F=57.84,P<0.05)。HGC-27细胞用0、0.5、1.0μmol/L 5-azacytidin处理后的DNM3相对表达量分别为0.316±0.038、0.770±0.031、0.877±0.052,3组比较,差异有统计学意义(F=156.30,P<0.05)。(4)胃癌中DNM3、p53的蛋白相对表达量。免疫印迹实验结果显示:转染DNM3质粒和对照质粒的AGS细胞中DNM3、p53的蛋白相对表达量分别为0.688±0.047、0.872±0.041和0.249±0.029、0.352±0.020;转染DNM3质粒和对照质粒的AGS细胞比较,上述蛋白相对表达量差异均有统计学意义(t=13.77,19.74,P<0.05)。转染DNM3质粒和对照质粒的HGC-27细胞中上述蛋白相对表达量分别为0.969±0.069、1.464±0.081和0.456±0.048、0.794±0.052,差异均有统计学意义(t=10.57,12.06,P<0.05)。(5)胃癌中DNM3相关性和富集性分析。相关性分析结果显示:DNM3与胃癌中RBMS3、CNTN4、PDE1A基因呈正相关(r=0.52,0.52,0.50,P<0.05),与SLC25A39、PAICS、GAPDH基因呈负相关(r=-0.41,-0.40,-0.40,P<0.05)。基因集富集分析结果显示:与核糖体和氧化磷酸化有关的基因集在DNM3低表达组中上调[富集分数(NES)=-3.30,-2.16,P<0.05],而淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用在DNM3高表达组中上调(NES=1.67,P<0.05)。基因本体论分析结果显示:DNM3低表达与有丝分裂姐妹染色体分离(编号:0000070)、无义介导衰变的核转录mRNA分解过程、姐妹染色体分离(编号:0000819)、核转录mRNA分解代谢过程、氧化磷酸化的调控有关(NES=-2.29,-3.10,-2.33,-2.56,-2.68,P<0.05)。京都基因与基因组百科全书分析结果显示:DNM3低表达在核糖体和氧化磷酸化中存在上调和串联(NES=-3.34,-2.21,P<0.05)。(6)流式细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期的比例。流式细胞周期实验结果显示:转染pCMV-DNM3质粒的AGS细胞G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为65.1%±3.0%、17.3%±3.0%、17.6%±1.0%,转染对照质粒的AGS细胞上述指标分别为53.4%±4.0%、26.3%±2.0%、20.3%±3.0%。转染DNM3质粒与转染对照质粒的AGS细胞比较,G0/G1期、S期差异均有统计学意义(t=4.05,4.32,P<0.05)。(7)胃癌中免疫细胞浸润和DNM3之间的相关性。免疫细胞浸润实验结果显示:DNM3 mRNA表达水平与肥大细胞,NK细胞,pDCs,B细胞,滤泡辅助T细胞,有效记忆T细胞,T细胞,中央记忆T细胞,CD8 T细胞,DC细胞,巨噬细胞,γ-δT细胞(Tgd),iDCs,嗜酸性粒细胞浸润水平呈正相关(Spearman相关系数分别为0.41,0.29,0.26,0.20,0.22,0.22,0.13,0.16,0.15,0.14,0.14,0.17,0.18,0.22,P<0.001,<0.001,<0.001,<0.001,<0.001,<0.001,P=0.015,0.002,0.004,0.005,0.005,P<0.001,<0.001,<0.001);与Th17细胞,Th2细胞,NK CD56dim细胞浸润水平呈负相关(r=-0.18,-0.23,-0.10,P<0.001,P=0.001和P=0.046)。(8)免疫组织化学染色检测与临床特征之间的相关性。免疫组织化学分析结果显示:DNM3在105例胃癌组织和105例配对正常组织中的免疫组织化学染色评分分别为3(2,4)分和6(4,9)分,差异有统计学意义(Z=-7.35,P<0.05)。70例DNM3低表达与35例DNM3高表达胃癌患者性别、肿瘤部位、N分期比较,差异均有统计学意义(χ^(2)=4.29,7.67,6.86,P<0.05)。(9)影响胃癌患者5年总生存率的独立因素分析。多因素分析结果显示:病理学T分期为T3~4期和DNM3染色评分低是胃癌患者5年总生存率的独立危险因素(风险比=1.91,0.51,95%可信区间为1.06~3.43,0.26~0.98,P<0.05)。DNM3低表达组胃癌患者和高表达组胃癌患者的5年总生存率分别为44.3%和65.7%,两者比较,差异有统计学意义(χ^(2)=5.02,P<0.05)。结论DNM3是一种肿瘤抑制因子,也是胃癌预后不良的独立预测因子,它可能通过甲基化调控胃癌的细胞周期和肿瘤微环境中的免疫抑制。