数字PCR检测HIV-1完整前病毒DNA方法的建立

目的通过数字PCR建立检测HIV-1完整前病毒DNA方法。方法通过培养8E5细胞(含有单拷贝整合HIV-1前病毒的T淋巴细胞系),提取DNA。通过连续稀释DNA,利用数字PCR扩增1倍、5倍、25倍、625倍、3125倍和15625倍稀释的HIV-1Ψ区、env区和真核细胞10号染色体RPP30区,计算线性关系及最低检测浓度。在数字PCR体系中分别加入5μl、3.1μl、2.5μl的DNA,各进行2批次检测,每批次重复检测4次,判断其批内变异系数,同核酸量和不同核酸量的批间变异系数判断稳定性。利用8E5 DNA检测细胞中完整前病毒含量。结果DNA在6个稀释度下,Ψ区、env区和RPP30区线性拟合优度分别是R^(2)≥0.999、R^(2)≥0.993、R^(2)≥0.996。当稀释到3125倍时,Ψ区、env区和RPP30区最低阳性液滴检出3个、2个和2个,检出浓度是2.37拷贝/μl、1.21拷贝/μl和1.58拷贝/μl。DNA的数字PCR重复性实验检测,Ψ区批内变异系数从0.66%到3.43%,同核酸量的批间变异系数分别是3.19%、4.3%和3.45%,不同核酸量的批间变异系数仅4.35%。env区批内变异系数从0.7%到3.2%,同核酸量的批间变异系数分别是3.18%、4.52%和3.4%,不同核酸量的批间变异系数仅4.02%。RPP30区批内变异系数从0.91%到2.91%,同核酸量的批间变异系数分别是3%、4.55%和3.37%,不同核酸量的批间变异系数仅在3.98%。8E5细胞中含缺陷前病毒的比例和含完整前病毒的比例分别是90%和45%。结论利用数字PCR能够检测HIV-1完整前病毒DNA,表现出较强的稳定性,为HIV-1感染者储存库检测提供技术手段。

无偿献血人群中HIV-1感染者env基因序列特征研究

目的分析我国无偿献血人群艾滋病病毒I型(HIV-1)感染者病毒亚型及env基因C2-V4区序列特征。方法针对我国13个省市献血人群筛选的115例HIV-1阳性标本,扩增HIV-1的env基因C2-V4区片段并测序;构建最大似然树(Maximum Likelihood)分析不同亚型env基因序列的进化关系;分析该基因区序列变异以及2G12、PGT135、PGT128中和表位特征。结果从115例HIV阳性标本中成功扩增C2-V4区76份,经测序分析发现HIV-1基因亚型7种,其中,亚型CRF01_AE和CRF07_BC所占比例最高,分别占46.0%(35/76)和39.5%(30/76),其他亚型CRF08_BC、B、CRF65_CPX、CRF59_01B、CRF61_BC所占比例分别为5.3%(4/76)、5.3%(4/76)、1.3%(1/76)、1.3%(1/76)、1.3%(1/76)。V3环顶端四肽存在GPGQ、GPGR、GPGK、GQGR四种类型,辅助受体以CCR5(90.8%)为主。97.1%的CRF01_AE毒株分别缺失2G12和PGT135抗体识别的相关糖基化位点,而CRF07_BC毒株100%缺失2G12抗体识别相关的糖基化位点,80%毒株未缺失PGT135抗体识别相关的糖基化位点。结论我国献血人群HIV-1感染者以CRF01_AE和CRF07_BC为主要流行毒株;各毒株亚型V3顶端四肽以GPGQ变异型为主,且主要使用CCR5为辅助受体;2G12、PGT135及PGT128中和抗体表位呈现不同程度的变异。该研究为进一步开展针对献血人群的艾滋病预防与控制提供了参考数据。

中国三省份未治疗HIV-1感染者临床毒株分离及其独特重组型的特征

目的分析未治疗的经性传播和注射吸毒感染HIV-1患者的病毒分离特征和独特重组型特征,为了解不同传播途径感染HIV-1的病毒生物学特性和精准防控提供依据。方法根据不同的HIV-1传播风险,筛选北京、广西、四川3个省市新诊断未治疗的HIV-1患者,静脉采血检测病毒载量、CD4^(+)T细胞计数,以及分离外周血淋巴细胞进行病毒分离,从病毒培养上清中提取RNA扩增全长序列,对序列进行分析。结果65名HIV-1感染者中,经男男性行为、异性性行为和注射吸毒感染分别为32(49.2%)、20(30.8%)和13(20.0%)例;亚型主要包括:26例(40.0%)CRF07C、23例(35.4%)CRF01E、9例(13.8%)独特重组型。共分离到46株HIV-1临床毒株,HIV-1分离阳性率与CD4^(+)T细胞显著负相关(χ^(2)=4.22,P=0.04),而与病毒载量正相关(χ^(2)=22.4,P<0.001);HIV-1的P24抗原含量多因素广义估计方程模型分析呈现类似结果。此外,广义估计方程模型显示P24抗原含量与培养时间正相关(52.14,95%CI:9.42~94.87,P=0.017),病毒生长曲线分析显示,在培养后第14天,男男性行为感染者的病毒P24抗原水平显著高于异性性行为和注射吸毒感染者(调整后P值分别为P<0.01和P<0.05)。9株独特重组型病毒均来自性传播感染者,男男性行为感染者中独特重组型的比例高于异性性行为感染者中的比例,且男男性行为感染者中的病毒基因重组断点多于异性性行为感染者。结论男男性行为感染者的血样对HIV-1病毒分离更敏感;性传播人群具有独特重组型多样性的特征,尤其是男男性行为感染者病毒基因重组更为明显。

一组靶向HIV膜蛋白的单克隆抗体的分离和功能鉴定

目的从中国人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type I, HIV-1)慢性感染者体内筛选针对膜蛋白的单克隆抗体并对其进行功能鉴定。方法采用单细胞特异性分选的方法从HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中筛选抗原特异性单个B细胞,通过逆转录和巢式PCR获得抗体重链和轻链的可变区基因。利用免疫遗传学数据库(immunogenetics database, IMGT)分析抗体基因家系及突变率。抗体表达纯化后,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)鉴定其结合活性和识别表位,通过假病毒中和实验检测抗体中和能力。结果从1例慢性HIV-1感染者样本中筛选得到7个HIV-1膜蛋白特异性抗体。抗体重链可变区基因来自IGHV1-69*09、IGHV1-08*01、IGHV1-46*01、IGHV4-34*01、IGHV4-61*01和IGHV3-43*02家系,突变率为10.76%~21.05%。轻链可变区基因来自IGKV3-20*01、IGKV1-39*01、IGKV1-NL1*01、IGKV3-15*01和IGKV1-9*01家系,突变率为6.03%~18.64%。7个抗体均可以结合gp140,其中抗体508-B1、508-C1、508-C5、508-D4和508-E5主要识别gp41区;508-D6和508-F1结合gp120区。508-D4和508-F1分别可以中和Global Panel假病毒盘中的CNE8(Tier 2)和X2278(Tier 2),IC50值分别为38.1 μg/ml和41.7 μg/ml。结论本研究成功筛选得到7个HIV-1膜蛋白特异性的单克隆抗体,其中5个为识别gp41区的单克隆抗体,2个为gp120结合抗体。2个抗体具备有限的中和能力。该组抗体可为HIV-1检测试剂和抗体药物研发以及艾滋病疫苗免疫原设计提供技术储备。

HIV-1 CRF07_BC病毒适应性的体外生长竞争试验的建立

目的:通过突变的方式构建含有鼠Thy1.1基因或鼠Thy1.2基因的HIV-1 CRF07_BC感染性克隆,建立CRF07_BC亚型体外竞争试验。方法:用鼠Thy1.1基因和鼠Thy1.2基因替换CRF07_BC亚型感染性克隆pXJDC6291-13 Nef区前218个碱基,构建成CRF07_BC感染性克隆BCEA1和BCEA2质粒。BCEA1和BCEA2进行293T细胞转染后获得病毒,测定病毒滴度,以等比例病毒含量共感染PM1细胞,在感染的第3、4、5、6天收集细胞并用Thy1.1和Thy1.2特异性抗体标记细胞,并进行流式细胞检测病毒适应性。通过"TFitness"程序(http://bis.urmc.rochester.edu/vFitness)计算病毒相对适应性。并观察耐药位点K103 N、多态性位点K166R相对于CRF07_BC亚型相对适应性的影响。结果:CRF07_BC亚型BCEA1和BCEA2两病毒的相对适应性(1+s)结果为1.06±0.23693,无统计学差异,建立了CRF07_BC亚型体外生长竞争性试验。利用该体外生长竞争试验验证K103 N和K166R突变株与野生株的相对适应性,BCEA2-K103 N/BCEA1相对适应性是0.728282±0.16608、BCEA2-K166R/BCEA1是0.883385±0.19023、BCEA2-K103 N+K166R/BCEA1是0.804604±0.06164。K103耐药位点突变株与野生株相对适应性存在统计学差异。结论:建立HIV-1 CRF07_BC病毒适应性的体外生长竞争试验,基于该体外竞争试验,HIV-1 K103 N的耐药毒株的病毒适应性降低。

使用活化诱导标记法评价HIV-1感染者特异性CD4^(+)T细胞免疫应答的研究

目的:建立一种检测HIV-1特异性CD4^(+)T细胞亚群功能的活化诱导标记法(activation-induced markers,AIM),从而更有效地评价HIV-1抗原特异性CD4^(+)T细胞免疫应答水平。方法:选取12例未经抗病毒治疗的HIV-1慢性感染者及6例未感染HIV-1的健康人,分别以基于多色流式细胞术的AIM法和细胞内因子染色法(intracellular cytokine staining,ICS)检测抗原特异性T淋巴细胞功能,并探讨两种方法用于评价HIV-1感染者抗原特异性T细胞免疫应答的能力。结果:AIM法检测HIV-1慢性感染者中HIV-1抗原特异性PD-1^(+)CD25^(+)CD4^(+)T、CD69^(+)CD200^(+)CD4^(+)T、CD69^(+)ICOS^(+)CD4^(+)T细胞阳性的比例为11/12、8/12和7/12,检测CD69^(+)ICOS^(+)CD8^(+)T、CD137^(+)CD69^(+)CD8^(+)T、PD-1^(+)CD25^(+)CD8^(+)、OX40^(+)PD-1^(+)CD8^(+)T细胞阳性的比例为8/12、8/12、7/12、7/12。ICS法检测HIV-1抗原特异性IL-2^(+)CD4^(+)T、IFN-γ^(+)CD4^(+)T、TNF-α^(+)CD4^(+)T细胞阳性的占比为2/12、2/12、0;IFN-γ^(+)CD8^(+)T、TNF-α^(+)CD8^(+)T、IL-2^(+)CD8^(+)T细胞阳性的占比为12/12、10/12、5/12。结论:AIM法在评价CD4^(+)T细胞功能方面更为敏感,可作为ICS法的补充,两种方法联合使用可更全面地评估抗原特异性T淋巴细胞反应。

在我国传播的HIV-1 CRF65＿CPX亚型毒株pol基因序列特征

目的探索亚型为CRF65_CPX艾滋病病毒（HIV）毒株在中国不同高危人群间的传播特征,基因序列及其CTL表位的变化。方法收集2017年6月之前中国鉴定HIV-1亚型为CRF65_CPX的毒株的pol基因区序列,使用比对好的pol基因区序列进行贝叶斯分析。以系统进化树为根据,选择其中同性性传播人群和异性性传播人群序列,分别生成共享序列后,比较两个人群氨基酸位点和HLA-B位点等位基因限制的CTL表位的差异。结果共收集获得CRF65_CPX HIVpol基因区序列52条。贝叶斯分析结果显示,异性性传播人群的最近共同祖先的时间为1999年,同性性传播人群的最近共同祖先的时间为2003年,CRF65_CPX毒株出现在异性性传播人群的时间早于同性性传播人群。与异性性传播人群相比,同性性传播人群pol区共享序列有10个氨基酸位点发生变化;丢失了两个有数据证明的保护性CTL表位（B＊2702、B＊5103）。结论 CRF65_CPX毒株为中国近些年才发现的多重重组的新型毒株,其在中国的传播途径从异性性传播转变为以同性性传播为主,氨基酸位点和CTL表位在传播过程中也产生了变化,这种变化可能加速了疾病进程,故应引起并加强对该亚型及其类似的新型病毒株不断扩散传播的重视。

Frequency of HLA-A*03 associates with HIV-1 infection in a Chinese cohort

During the early mid-1990s,a number of rural farmers across central China were employed to the unregulated plasmaselling-activity and many of them were infected by HIV-1.However,AIDS progression in the former blood donors(FBDs)is various.The aim of this study is to assess human leukocyte antigen(HLA)class I allele distribution in FBDs and evaluate its association with HIV-1 infection and disease progression.A total of 353 FBDs were enrolled in the cohort including 294 ART na ve HIV-1 seropositive and 59 HIV-1 seronegative age-matched subjects.The viral load and CD4/CD8 T cell counts were assessed in all subjects.Compared with HIV-seropositive group,the frequency of HLA-A*03 in control was significantly higher.After classifying the HLA-B alleles of the subjects according to the presence of Bw4/Bw6 serological epitopes,detrimental effect of HLA Bw6/Bw6 homozygosity was also confirmed in the HIV-seropositive subjects.This study provides novel evidence on HLA class I allele distribution and association of HLA-A*03 frequency with HIV-1 infection and viremia in the HIV-1 infected FBDs,which may throw light on intervention strategy for the HIV-1 infection and our understanding how host immunity and genetic background affect HIV infection and AIDS progression.