Developing a duplex ARMS-qPCR method to differentiate genotype Ⅰ and Ⅱ African swine fever viruses based on their B646L genes

Africanswinefever(ASF),causedbythe African swine fever virus (ASFV), is an acute, hemorrhagic, and contagious disease of domestic pigs and wild boars.The disease is notifiable and listed by the World Organization for Animal Health (WOAH)(Wang N et al. 2019).

靶向非洲猪瘟病毒EP152R基因sgRNA细胞系的构建及其对ASFV复制影响的研究

有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt~72845nt)的sg RNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sg RNA的编辑效率确定最佳sg RNA。结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sg RNA,其中3对sg RNA对EP152R基因的编辑效率达30%~42%,另外两对sg RNA的编辑效率低于10%。将筛选的3对sg RNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sg RNA的细胞WSL-g REP152R,并采用western blot鉴定。结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sg RNA的细胞系WSL-g REP152R-1/2/3。将携带m Cherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-g REP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h)。观察结果显示,随感染时间的延长WSL-g REP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-g REP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者。q PCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-g REP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-g REP152R-2中的病毒效价最低。将m Cherry-ASFV感染各WSLg REP152R细胞并连续传3代,采用q PCR检测F2、F3代细胞上清液中的病毒扩增的Ct值。结果显示,与WSL细胞相比,各WSL-g REP152R细胞F2代上清液中ASFV扩增的Ct值均极显著升高(P<0.01),且WSL-g REP152R-2 F2代及WSL-g REP152R-1/2 F3代细胞上清液中均检测不到病毒扩增的Ct值。上述结果表明,本研究设计的sg RNA能够有效靶向ASFV EP152R基因并敲除该基因进而抑制ASFV及其子代病毒的复制,且g REP152R-2抑制ASFV复制的效果最好。本研究为ASFV疫苗的开发及抗ASF育种猪提供重要参考数据。

非洲猪瘟病毒pA104R蛋白单克隆抗体的制备与应用

为了给非洲猪瘟的临床诊断技术和实验室研究提供物质基础,本研究以我国首次分离的非洲猪瘟病毒(ASFV)Pig/HLJ/2018株基因组为模板,扩增pA104R基因,并将其克隆至pET-30a载体,构建重组原核表达质粒pET-30a-A104R,表达并纯化重组pA104R蛋白(rpA104R),以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体(MAb),并采用ELISA、western blot、间接免疫荧光法(IFA)和免疫组化(IHC)对所获得的MAb进行鉴定。结果显示,正确构建p ET-30a-A104R重组质粒,并获得大小约为12 ku的可溶性蛋白。通过间接ELISA方法筛选到2株阳性杂交瘤细胞株为4G2和4E10,并且2株MAb的重链均为IgG1,轻链为Kappa链。Western blot和IFA结果显示,MAb 4G2株能够特异性地识别ASFV pA104R蛋白和病毒感染的猪肺泡巨噬细胞中表达的pA104R蛋白。IHC结果表明,MAb 4G2可以与病毒感染的阳性猪组织发生特异性反应。本研究也为ASFV基因缺失疫苗的开发提供了技术储备。

非洲猪瘟病毒引物解旋酶C962R转录水平的动态分析及其互作病毒蛋白的鉴定

为筛选与非洲猪瘟病毒(ASFV)引物解旋酶C962R互作的病毒蛋白,本研究将ASFV Pig/HLJ/2018株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后20 h内每间隔2 h收获细胞,通过荧光定量PCR检测C962R基因的动态转录水平。结果显示,ASFV感染PAM后6 h C962R基因的转录水平明显增加,18 h达峰值。经PCR扩增质粒pmCherry的mCherry基因、ASFV基因组中距C962R基因起始密码子41 bp(内含子部分)处上游约1000 bp的基因序列、距C962R N端约1000 bp的基因序列(该N端融合Strep标签)及C962R基因起始密码子上游的41 bp(内含子部分)基因序列后,构建重组质粒p3X-MCS-C962R-mCherry,并经双酶切鉴定正确后转染PAM,采用Pig/HLJ/2018株感染该PAM,48 h后分别收获上清液和细胞,采用PCR和western blot鉴定获得的重组病毒。结果显示,上清液中出现约1000 bp的包含mCherry和Strep标签的基因片段及PAM中出现100 ku的特异性条带,表明获得了融合表达C962R蛋白和Strep标签的重组ASFV(rC962R-mCherry)。将慢病毒包装质粒和辅助质粒共转染HEK 293T细胞,利用嘌呤霉素筛选融合表达C962R蛋白和Strep标签蛋白的细胞并经western blot鉴定。结果显示,细胞中出现100 ku的特异性条带,表明获得了表达ASFV C962R蛋白的细胞PK-15-C962R-Strep。分别将rC962R-mCherry感染PAM、ASFV Pig/HLJ/2018株感染PK-15-C962R-Strep,通过这两种感染方式经Strep pull-down试验检测C962R蛋白及筛选与其互作的病毒蛋白,并经质谱鉴定互作病毒蛋白的种类。采用PCR将Strep标签融合于筛选出的病毒蛋白编码基因的C端,分别克隆至pCAGGS载体,获得分别表达各病毒蛋白的重组质粒。将表达各病毒蛋白的重组质粒分别与表达C962R-Strep的重组质粒共转染HEK293T细胞,36 h后采用Co-IP试验进一步验证获得的与ASFV C962R蛋白互作的病毒蛋白。Strep pull-down试验结果显示,rC962R-mCherry感染的PAM细胞、ASFV Pig/HLJ/2018株感染的PK-15-962-Strep细胞中均出现100 ku的特异性条带。质谱鉴定结果显示,共筛选出3种病毒蛋白:A137R、K145R和K205R蛋白。Co-IP结果显示,IP样品中分别出现约16 bp、17 bp的特异性条带,对应为病毒的A137R和K145R蛋白。表明仅有A137R和K145R蛋白与C962R蛋白存在相互作用。本研究为以C962R蛋白为靶蛋白的新型抗ASFV药物及疫苗的研发提供实验依据。

我国出现基因Ⅰ型非洲猪瘟病毒:低致病力,有效传播能力

非洲猪瘟(ASF)于上世纪20年代首次报道于非洲的肯尼亚,后传入欧洲与南美等地。2018年8月3日首次发生于我国辽宁省沈阳市。目前全球已鉴定出至少24种基因型的ASFV,大部分流行于非洲。基因I型ASFV曾于上世纪50~90年代流行于葡萄牙、西班牙、古巴、巴西等国家,而欧亚大陆国家主要流行2007年与格鲁吉亚疫情同源的基因II型ASFV。