原位杂交研究对虾白斑杆状病毒在虾体内感染过程

应用地高辛标记的对虾白斑杆状病毒 (whitespotsyndromebaculovirus,WSSV)核酸探针 ,与人工感染后不同时间采集的对虾组织样品进行原位杂交 ,以动态研究病毒从侵染至对虾发病死亡的过程。将典型感染WSSV的病虾组织投喂健康对虾 ,结果显示 :WSSV首先通过侵染消化道上皮进入虾体内增殖 ,此后随着细胞裂解、病毒粒子释放 ,游离的病毒粒子伴随血淋巴循环进而侵染其它靶组织 ,直至对虾发病死亡。

对虾白斑综合征杆状病毒体内增殖模型的建立

应用对虾白斑综合征杆状病毒（WSSV），对淡水克氏螯虾、罗氏沼虾、日本沼虾和两种淡水蟹（中华绒螯蟹、长江华溪蟹）进行人工感染实验。结果除淡水克氏螯虾之外，其它受试的虾蟹均不能感染WSSV。克氏螯虾3个不同剂量级感染至12d平均死亡率为94％。从发病或死亡个体采集血淋巴，经电镜负染色可观察到完整的病毒粒子，其形态大小、靶细胞组织病理均与从中国对虾中分离的WSSV相似或相同。同时，通过原位杂交技术进一步证明该实验的可靠性。克氏螯虾重复感染效果良好，有可能成为研究WSSV的一种理想的病毒体内增殖模型。

中国对虾杆状病毒基因克隆及探针制备与检测

从收集的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）病虾样品中分离到一种杆状病毒，经负染在电镜下观察，完整病毒粒子大小为１１０×２８０～３２０ｎｍ。病毒核酸经ＥｃｏＲＩ酶切，克隆到ｐＵＣ１８质粒上，经筛选得到两个克隆Ｌ４６、Ｍ１３，克隆片段分别为２．１４ｋｂ和３．５８ｋｂ。将这两个基因片段和对虾白斑综合征杆状病毒（ＷｈｉｔｅＳｐｏｔＳｙｎｄｒｏｍｅＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，简称ＷＳＳＶ）基因克隆片段Ａ２６制备探针，共同用点杂交法对我国沿海地区的病虾样品进行检测，以了解我国沿海地区对虾杆状病毒的分布，并确定中国对虾杆状病毒与ＷＳＳＶ的同源性。