HCV干扰素敏感决定区“基因盒”的构建,体外表达及功能探讨

目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合成寡核苷酸,PCR,分子克隆等方法构建ISDR基因“盒”,包括3个对干扰素敏感的丙肝患者ISDR及1个对干扰素耐受的丙肝患者ISDR,将含不同ISDR的NS5A基因克隆进原核表达载体PRSET,转染BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得蛋白过柱纯化及透析去掉高盐后,与经体外转录和翻译系统获得的PKR进行蛋白结合试验.结果:经测序证实获得4个不同ISDR基因,包括1个对干扰素不敏感基因和3个对干扰素敏感基因;体外表达的含ISDR的NS5A蛋白约58000,体外试验初步证实,无论对干扰素敏感或不敏感的ISDR均可与PKR结合.结论:体外构建的含不同ISDR的NS5A蛋白能在原核细胞系统中获得较好表达;研究显示,ISDR影响干扰素抗病毒作用可能不是由ISDR与PKR直接结合导致的.