囊泡型H^＋-ATPase B1亚基的突变对大鼠内髓集合管细胞H^＋-ATPase结构和泵氢功能的影响

目的研究致遗传性远端肾小管酸中毒（dRTA）的囊泡型H^＋-ATPaseB1亚基（ATP6V181）的点突变对大鼠内髓集合管（IMCD）细胞H^＋-ATPase结构和泵氢功能的影响。方法模拟致人类遗传性dRTA的B1亚基点突变构建野生型（WT）和7种突变型（M）质粒，转染大鼠IMCD细胞并筛选稳定表达绿色荧光蛋白（CFP）-B1 M和GFP—B1 WT的IMCD细胞系。应用免疫荧光、免疫蛋白印迹法、ATP。NADH耦合实验和快速酸负荷后不依赖钠的细胞内pH的变化，来观察GFP—B1 M和GFP—B1 WT在细胞内的分布，及其与H^＋-ATPase其他（E、H和c）亚基结合能力对ATP酶活性和H^＋-ATPase泵氢功能的影响。结果GFP．B1wT在转染细胞中呈囊泡样分布，与H^＋-ATPase的分布一致；而GFP—B1 M则为弥散分布。免疫沉淀结果显示只有GFP—B1 WT融合蛋白能和其他的H^＋-ATPase亚基（E、H和c）结合形成复合物，而GFP-B1 M融合蛋白无此作用。ATP酶活性只有在GFP—B1 WT转染细胞株的免疫沉淀产物中存在，在GFP—B1 M转染细胞株的免疫沉淀产物中不存在。在GFP—B1 M转染的IMCD细胞快速酸负荷后H^＋-ATPase介导的钠不依赖pHi的恢复受到显著抑制[pHi的恢复率（pHU／min）在L81P、R124W、M174R、P275R、G316E、P346R、G364S GFP—B1M转染的IMCD细胞分别为0．007±0．002、0．004±0．002、0．002±0．002、0．003±0．002、0．006±0．004、0．009±O．004、0．015±0．006，P〈0．05，n=51。而GFP—B1 WT转染的IMCD细胞pHi的恢复率与未转染IMCD细胞相似[（0．040±0．006）pH U／min]，且能被1μmol／L巴弗洛霉素（H^＋-ATPase特异性抑制剂）所抑制。结论遗传性dRTA囊泡型H^＋-ATPaseB1亚基点突变影响GFP—B1融合蛋白与其他亚基正常结合组装形成完整的H^＋-ATPase，并抑制H^＋-ATPase的泌酸功能。