基于Ⅰ型登革病毒全球统一基因分型协同监测策略的纳米孔测序溯源技术体系的建立与初步应用

目的基于全球统一DENV-1基因分型协同监测策略构建纳米孔测序溯源技术体系,并初步应用于患者血清样本测试。方法基于全球DENV整合序列资源数据库GISDD v1.2.1中DENV-1全基因组序列集,利用MEGA 7.0、primer-BLAST、MPprimer和GISDDrPrimer软件筛选、设计和评价特异性的靶向多重PCR引物对;提取血清样本RNA和逆转录;16对引物分配至2个引物池,多重PCR扩增靶标基因组序列;使用磁珠纯化,根据SQK-LSK109试剂盒操作流程构建文库,使用MinION测序;分析测序数据并组装基因组,以GISDD基因分型平台进行溯源分析。结果设计并鉴定了16对与GISDD所收录基因组序列具有高覆盖度的DENV-1引物,建立了DENV-1特异性多重PCR靶向纳米孔高通量测序技术体系。初步应用于13例广州登革热患者血清样本的全基因组检测,读长(reads)平均长度中值为1668.00 bp,测序平均质量中值为9.30,比对率中值为97.90%,比对上参考基因组NV46的平均长度中值为1677.90 bp,基因组平均深度中值为12886.40×。进一步基于GISDD基因分型和溯源分析发现,9个隶属DENV-1基因分支1E1、3个为1L1、1个为5C1。结论纳米孔测序DENV-1全基因组检测体系稳定可靠,可获得高质量DENV-1全基因组序列,为登革热疫情暴发中DENV-1基因组的快速侦检与溯源追踪提供了有效的技术方案,为建立登革热的全球协同监测控制体系奠定技术基础。