小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化中Notch信号相关基因表达分析

目的:检测骨髓基质细胞系Kusa-A1成骨分化过程中Notch信号相关分子的表达变化,分析Notch信号途径在成骨细胞分化和骨形成中的可能作用.方法:培养小鼠Kusa-A1细胞,在常规培养和诱导培养(添加维生素C和β磷酸甘油)条件下用Real-time PCR方法分别检测Delta1、Jagged1、Notch1、CBF1、HES1基因的表达变化.同时也检测了成骨标志基因骨桥蛋白(OPN)的表达变化.结果:常规培养下Kusa-A1细胞汇片后0～5d,OPN表达有轻微下调,Notch相关分子表达维持不变或有轻微下调.诱导培养条件下细胞汇片后0～5d,OPN表达上调,而Delta1、Jagged1、Notch1、HES1表达大幅度下调,惟有CBF1表达有轻度上调趋势.结论:Notch信号分子表达与Kusa-A1细胞成骨分化负相关,Notch信号对细胞成骨分化可能有抑制作用,而CBF1则可能对成骨细胞分化有正向调节作用.

转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对Cbfa1和Ose2元件启动子活性的影响

目的探讨Notch信号转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对核心结合因子Cbfa1基因启动子和骨钙素基因启动子区域Ose2元件启动子活性的影响。方法构建CBF1真核表达载体pCMV-Tag4/CBF1;将梯度浓度pCMV-Tag4/CBF1和荧光素酶报告质粒共转染两成骨前体细胞系Kusa-A1和Kusa-O,用双荧光素酶报告基因方法检测Cbfa1和Ose2元件启动子活性。结果随CBF1浓度增加,Kusa-A1和Kusa-O细胞中Cbfa1和Ose2元件启动子活性均逐渐提高。统计分析表明Kusa-A1细胞中1/40μg/μL实验组两启动子活性均与对照组差异显著;Kusa-O细胞中1/40μg/μL实验组Ose2元件启动子活性与对照组差异显著。结论转录调控因子CBF1可以促进Cbfa1和Ose2元件启动子活性,从而可能对细胞的成骨性分化有正调节作用。

小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化中CBF1的作用

目的揭示CBF1在骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化过程中的作用。方法采用基因转染法建立CBF1稳定过表达细胞系Kusa-A1/CBF1,检测其成骨活性。指标包括细胞钙沉积能力、碱性磷酸酶活性、体外钙化结节(CN)形成、实时PCR测定细胞骨钙素(OC)和骨桥蛋白(OPN)基因表达、蛋白印迹检测细胞RANKL蛋白。最后用报告基因法检测CBF1对HES1启动子活性的影响。结果经RT-PCR和Western blot鉴定,Kusa-A1/CBF1细胞建立成功。与对照细胞系Kusa-A1/host相比,Kusa-A1/CBF1细胞的钙沉积能力、CN形成能力均显著提高;Kusa-A1/CBF1细胞OC和OPN基因表达和RANKL蛋白水平明显高于对照细胞。瞬时转染Notch的细胞内结构域NICD促进HES1的启动子活性,这一作用被CBF1强烈抑制。结论CBF1可以促进Kusa-A1的成骨分化,该作用至少部分是通过影响Notch信号实现的。

小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1体外成骨活性评价

目的：检测骨髓基质细胞系Kusa-Al体外成骨活性，分析其用于成骨细胞功能和分化机制研究的价值。方法：培养Kusa-Al细胞，在常规培养和成骨诱导培养条件下，分别检测细胞的体外成骨活性，包括碱性磷酸酶(ALP)活性、细胞钙沉积能力、体外矿化结节(CN)形成能力、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(0c)表达水平、NF-κB受体激活因子(RANKL)水平。结果：常规培养下，Kusa-Al细胞表现出较高碱性的ALP活性(约为0．75IU／mg)、一定的钙沉积能力，并可检测到OPN和OC表达，但无CN形成，RANKL蛋白低于可检测水平。诱导培养条件下，细胞ALP活性先升高后降低、钙沉积量持续升高、OPN和OC表达水平后期显著提高，汇片后3～7d检测到大量CN形成，汇片后24h可检测到RANKL蛋白。结论：Kusa-Al可能是一种成骨前体细胞，经诱导可以向成骨细胞分化，在体外表现出良好的成骨细胞活性。Kusa-Al细胞可作为成骨细胞功能及其分化机制研究的模型细胞。

小鼠骨组织中转录调控因子CBF1的表达

目的:探讨转录调控因子CBF1(Cpromoterbindingfactor1,CBF1)在成鼠骨组织以及小鼠胚胎性骨组织的表达情况.方法:采用实时RTPCR方法检测包括骨组织在内的成年小鼠13种器官组织中CBF1的相对表达水平.采用组织原位杂交技术检测小鼠胚胎性趾骨、肋骨和椎骨中CBF1的分布.结果:转录调控因子CBF1在成年小鼠各组织器官中广泛存在,在骨组织中检测到较高的CBF1表达水平.原位杂交分析显示:发育中的趾骨和肋骨软骨细胞CBF1阳性染色,染色阳性程度与软骨细胞的分化程度有关;肋骨和椎骨骨化区周围成骨细胞呈强阳性染色;埋入骨基质的骨细胞则呈弱阳性染色.结论:转录调控因子CBF1参与了小鼠骨组织的发育形成,可能也参与了成熟骨组织的改建和代谢.