超声波辅助农杆菌介导CP基因转化番小瓜(Carioca papaya L.)的有效方法

本研究探索了通过农杆菌介导,超声波辅助处理,转化番木瓜胚性愈伤组织,获得转基因植株的有效方法。分别将含有日本PLDMV 外壳蛋白基因(PTi-Epj-TL-PLDMV)和含有台湾PRSV 菌株、美国夏威夷PRSV 菌株、泰国PRSV 菌株及日本PLDMV 菌株的多元外壳蛋白基因编码序列(PTi-NP-YKT)插入双元载体质粒pGA482G,借助于农杆菌系LBA4404将双元载体上的外壳蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)转移到番木瓜品种Sunset 的胚性愈伤组织中,从而获得抗卡那霉素的转化再生植株。试验着重在转化方法上进行探索。结果表明,农杆菌过夜培养后,用高渗透压培养液(1/2 MS+6%蔗糖+1%葡萄糖,pH 5.7)调整至光密度OD_(600(?)m)=0.15-0.20,然后用该菌液感染材料30min,其间辅以超声波处理,可以大大提高转化效率。用15ml 无菌离心管装载胚性愈伤材料进行15s 的超声波处理,在80块被转化的胚性愈伤中获得21个CP 基因G 转化系(26.3%),而在对照处理64块胚性愈伤中仅获得1个转化系(1.6%);在经过15s 的超声波处理48块被转化的胚性愈伤中获得8个CP 基因B 转化系(16.7%),而在对照处理25块胚性愈伤中未出现转化系。上述操作方法用在两种CP 基因转化上均表现出相似的效果。试验还表明:120mg/L 是卡那霉素抗性筛选的最佳浓度。抗性筛选9个月后,在421块胚性愈伤组织中产生了42个抗卡那霉素的转化系。所获得的转基因植株分别用PCR 和Southern 印迹杂交进行了鉴定。

苹果花药培养不定胚诱导条件的优化

为进一步提高苹果花药培养不定胚诱导率,本研究以‘丹霞’、‘富士’、‘嘎啦’、‘红星’、‘红玉’、‘津轻’、‘硕红’、‘千秋’、‘珊夏’‘、王林’、‘祝光’、‘wijcik’等12个苹果品种和八棱海棠、山定子的花药为试材进行培养,分析研究了不同基因型、低温预处理、培养基中蔗糖浓度、凝固剂、活性炭以及培养条件等对不定胚形成的影响,结果表明12个苹果品种中‘祝光’不定胚诱导率最高,高达34.3%,其次为‘红星’11.9%和‘千秋’5.1%,‘王林’没有诱导形成不定胚;八棱海棠、‘丹霞’、‘富士’和‘嘎啦’4个基因型在低温预处理30 d以后均表现出随低温处理时间延长不定胚诱导率显著增加的趋势;培养基蔗糖浓度为5%、凝固剂为0.75%Bactagar有利于不定胚和愈伤组织的诱导;培养基中添加一定浓度的活性炭有利不定胚的诱导;25℃恒温是进行苹果花药培养的适宜条件。研究结果为建立高效且适宜苹果遗传转化的苹果不定胚再生体系提供了理论基础,同时丰富了纯合基因型株系群体,为进一步的遗传分析提供了研究材料。