τ蛋白磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性的体外分析

目的 探讨 Alzheimer病 (AD) τ蛋白异常磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性抑制的关系。方法 采用超速离心和离子交换柱层析法分离制备重组 τ蛋白及 τ蛋白的体外磷酸化 ,以 Fe Cl3亲和柱分离纯化 32 Pτ肽 ,手工 Edman降解和氨基酸自动分析仪鉴定 32 Pτ肽磷酸氨基酸位点。结果 (1)酪蛋白激酶 - 1(CK- 1)、c AMP依赖性蛋白激酶 (PKA )和糖元合成酶激酶 - 3(GSK- 3)的磷酸化作用可不同程度地抑制τ蛋白的功能 ,CK - 1或 PKA的预处理可明显增强 GSK - 3对τ促微管组装活性的抑制 ,其中 PKA加 GSK- 3的抑制作用最强。 (2 )单纯GSK- 3磷酸化τ蛋白的位点为 :苏氨酸 (Thr) - 181,丝氨酸 (Ser) - 184,Ser- 2 6 2 ,Ser- 35 6和 Ser- 40 0 ,而 GSK- 3对PKA预处理τ蛋白的磷酸化位点为 :Ser- 195 ,Ser- 198,Ser- 199,Ser- 2 0 2 ,Ser- 2 35 ,Ser- 2 6 2 ,Ser- 35 6 ,Ser- 40 4,Thr-2 0 5和 Thr- 2 31。其中 Ser- 198,Ser- 199,Ser- 2 0 2 ,Thr- 2 0 5 ,Thr- 2 31,Ser- 2 35 ,Ser- 2 6 2 ,Ser- 40 0和 Ser- 40 4为 AD患者τ蛋白异常磷酸化位点。此外 ,Ser- 2 6 2磷酸化仅轻度抑制τ蛋白活性 ,而 Ser- 198,Ser- 199,Ser- 2 0 2 ,Thr- 2 31,Ser- 2 35 ,Ser- 40 0和 Ser- 40

去磷酸化对Alzheimer神经原纤维缠结结构和功能的影响

探讨去磷酸化作用对Alzheimer神经原纤维缠结结构和功能的影响。结果发现,将蛋白磷酸酯酶—2A或—2B型与Alzheimer神经原纤维缠结在37℃保温45min可使缠结结构松解,神经原纤维缠结的基本单位双螺旋丝的螺旋性趋于消失;延长去磷酸化反应时间至3h可使缠结结构进一步松解,产生大量单个螺旋丝原纤维,并释放大量游离双螺旋丝片段和比对照组高约25％的游离tau蛋白;去磷酸化作用可不同程度恢复神经原纤维缠结中tau蛋白促微管组装的生物学功能。这从结构和功能双重角度证明了Alzbeimer病脑病理损伤的可逆转性,为Alzheimer病治疗的可能性提供了实验依据。