枯草杆菌ylyA基因的绿色荧光蛋白标记

【目的】本研究对枯草杆菌ylyA基因进行荧光标记以便对其产物YlyA在菌体中的位置进行初步观察。【方法】以不同菌株基因组DNA为模板,对ylyA基因进行PCR扩增和序列分析;重新设计引物扩增全长的ylyA并将其克隆到载体pSG1729中,形成gfpmut1-ylyA融合而构建重组载体pNG426;将pNG426转化枯草杆菌168菌株,双交换使gfpmut1-ylyA插入染色体的amyE位点,用碘染色法和菌落PCR对阳性转化子BS363进行鉴定。NA固体培养基上生长的BS363经0.5%木糖诱导表达后,利用表面荧光显微镜技术进行观察。【结果】通过对多个PCR产物的序列分析确定了ylyA基因的正确序列以及正确的翻译起始位点;成功将重组载体pNG426转化枯草杆菌得到了BS363菌株;荧光检测结果表明GFP标记的YlyA分布于菌体的外周,在位置上靠近细胞膜并与之平行排列。【结论】生长缓慢的BS363菌体,在0.5%木糖诱导下产生的荧光标记YlyA蛋白分布在细胞外周,可能在膜生物学中发挥作用。

枯草杆菌ylmK基因的荧光标记及Ylmk蛋白的亚细胞定位

目的:对枯草杆菌ylmK基因进行3'端荧光标记以便对其产物YlmK蛋白在菌体中的位置进行初步观察。方法:以BS168菌株基因组DNA为模板,PCR扩增ylmK基因的3'端序列,并将其克隆到载体pSG1164中,形成ylmK'-gfpmutl融合,构建重组载体pNG424;将pNG424转化枯草杆菌168菌株,单交换形成完整的功能性3'端gfpmutl标记的ylmK基因,菌落PCR对阳性转化子BS362进行鉴定,用表面荧光显微镜技术对BS362进行观察。结果:荧光检测结果表明GFP标记的YlmK分布于菌体的外周,在位置上靠近细胞膜并与之平行排列。结论:YlmK是一种膜蛋白。

YlyA和RNA聚合酶的反应性鉴定

目的:用亲和层析法鉴定YlyA与RNA聚合酶(RNAP)的结合性能。方法:将YlyA分别上样于以Affigel15为亲和介质制备的空白柱、牛血清白蛋白(BSA)柱和RNAP柱;以GreA和绿色荧光蛋白(GFP)为阳性和阴性对照蛋白分别上样于同一RNAP柱,洗涤和洗脱缓冲液(pH均为7.9)的盐离子浓度分别为30 mmol/L和400 mmol/L;用免疫印迹法对洗涤和洗脱流出液中的YlyA进行检测。结果:在空白柱和BSA柱的洗脱收集液中,没有检测到YlyA,大量的YlyA出现在了洗涤收集液中;而在RNAP柱的洗脱收集液中,检测到了YlyA和GreA,没有检测到GFP。结论:YlyA与RNAP之间具有特异性结合能力,为YlyA极有可能是一种转录因子的生物信息学分析结果提供了实验证据。