汉寿中华鳖线粒体细胞色素b基因克隆及其遗传多样性分析

本文以汉寿中华鳖为研究材料,比较分析中华鳖线粒体细胞色素b基因(Cytb)与瑞鳖、砂鳖等的差异,为探讨其进化与遗传分子标记奠定实验基础。采用PCR技术,克隆汉寿中华鳖Cytb基因的序列,并检测其在不同组织以及不同生长发育时期的表达模式,最后通过分子进化树分析中华鳖与砂鳖的亲缘关系。通过克隆发现中华鳖细胞色素b基因的mRNA开放阅读框含有1 140 bp,其碱基组成为A+T的含量(61. 1%)高于G+C(38. 9%),编码379个氨基酸残基的序列。与山瑞鳖和砂鳖氨基酸序列比较发现,中华鳖与瑞鳖和砂鳖均存在一定差异; Cytb基因在中华鳖不同组织和各个不同发育时期中均有表达,且在精巢组织中表达量最高,在不同时期阶段呈"低-高-低"曲线表达模式;分子进化树分析发现汉寿中华鳖与砂鳖具有较强的亲缘关系,但是在Cytb中仍存在差异,所以能够很好的把它们区分开来。此外汉寿中华鳖与哺乳动物、鱼类和爬行类均存在巨大差异。结果表明,Cytb基因在探讨汉寿中华鳖的进化与遗传分子标记中具有重要意义,可作为分析中华鳖种属进化系统发育特性和群体遗传多样性的标记基因。

Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates cardiac remodeling and improves cardiac function in pressure-overloaded heart failure mice

Objective To investigate the effect of bilateral superior cervical ganglionectomy on cardiac remodeling and function in pressure-overloaded heart failure(HF)mice.Methods Pressure-overloaded HF mouse model was produced by severe thoracic aorta banding(sTAB).

双羟基黄酮醇抑制心衰后CaMKⅡ磷酸化降低室性心律失常易感性

目的:研究双羟基黄酮醇(DiOHF)通过抑制心衰(HF)后钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的磷酸化水平来降低心衰后室性心律失常的易感性。方法:采用主动脉缩窄术(TAC)构建压力负荷性心衰小鼠模型,用小动物超声机确认模型构建成功。假手术组小鼠分为Control组和Control+DiOHF组,心衰小鼠分为HF组和HF+DiOHF组。采用心内程序性电刺激(PES)分别检测4组小鼠的心室起搏阈值和心室不应期,诱导室性心律失常并进行心律失常评分。采用Western Blot分析各组心脏蛋白中的CaMKⅡ及其磷酸化水平。结果:与Control组相比,HF组小鼠的心室起搏阈值减小,不应期缩短,室性心律失常评分显著增高。而HF+DiOHF组相比HF组起搏阈值增大,心室不应期增长,室性心律失常评分显著降低。同时Western Blot显示HF组相比Control组,CaMKⅡ磷酸化水平显著升高,而HF+DiOHF组CaMKⅡ磷酸化水平相比HF组明显下降。结论:CaMKⅡ的过度激活引起心衰后的室性心律失常,而DiOHF可通过抑制心衰后CaMKⅡ的磷酸化水平来减少室性心律失常。

动脉粥样硬化患者外周血单核细胞差异表达基因分析及生物标志物筛选

目的研究及分析动脉粥样硬化患者外周血单核细胞差异表达基因,筛选动脉粥样硬化潜在的分子标志物。方法通过GEO数据库获取GSE23746和GSE9820基因芯片数据集。GSE23746包含了76例就诊于华盛顿大学附属医院的颈动脉粥样硬化患者及19例对照者的单核细胞样本。GSE9820包含了18例就诊于荷兰阿姆斯特丹自由大学医学中心的重度病变的冠心病患者及13例对照者的单核细胞样本。分别筛选颈动脉粥样硬化患者及冠状动脉粥样硬化患者相对于对照组的差异表达基因,并确定两个数据集的共同差异表达基因。然后对差异表达基因进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。再对差异表达基因进行蛋白相互作用网络(PPI)分析,并选出关键基因。结果在颈动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化患者的外周血单核细胞中分别筛选出16个和153个下调的差异表达基因。颈动脉粥样硬化的差异表达基因主要参与炎症反应、中性粒细胞趋化、免疫应答等生物过程;富集到的KEGG通路包括Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路。冠状动脉粥样硬化的差异表达基因主要参与的生物过程包括核小体装配、凝血、基因表达的调控;富集到的KEGG通路包括系统性红斑狼疮以及细胞因子趋化通路。通过构建PPI网络,在颈动脉粥样硬化患者中识别出5个枢纽基因TNF、IL1B、趋化因子(C-X-C基序)配体8(CXCL8)、趋化因子(C-C基序)配体4(CCL4)、B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子(NFKBIA),在冠状动脉粥样硬化患者中识别出5个枢纽基因(组蛋白HIST1H2AC、HIST1H2BJ、HIST1H2BH、HIST2H2AC、HIST2H2BE),这些基因主要参与炎症反应及炎症信号分子的转录和表达。同时还筛选出两个数据集的共同差异表达基因早期生长反应基因1(EGR1)和趋化性细胞因子配体CCL3样蛋白1(CCL3L1)。结论基于GEO数据库的生物信息学分析,动脉粥样硬化患者外周血单核细胞的炎症信号被抑制;共同差异表达基因EGR1和CCL3L1可作为潜在的生物标志物用于动脉粥样硬化的筛查。这为动脉粥样硬化的机制研究和临床诊疗提供新的思路。

双侧颈上神经节切除对压力负荷型心力衰竭小鼠心室重构及心功能的影响

目的:探讨双侧颈上神经节切除对压力负荷型心力衰竭(心衰)小鼠心室重构及心功能的影响。方法:健康雄性6周龄C57BL/6小鼠共24只,体重20~25 g。采用随机数字法分为4组,即对照组( n=6,进行假手术)、去神经组( n=6,手术切除双侧颈上神经节)、心衰组[ n=6,采用重度胸主动脉缩窄术(sTAB)建立压力负荷型心衰模型]和心衰去神经组( n=6,于sTAB术后2周行双侧颈上神经节切除术)。分别于sTAB术前以及后第2、3、4周行超声心动图检测小鼠心功能。于sTAB术后第4周末处死小鼠,取心肌组织。心肌组织切片行苏木素-伊红(HE)、Masson和免疫组织化学染色进行心肌形态和组织学分析;提取心肌组织蛋白,采用Western blot法检测其酪氨酸羟化酶(TH)、B型利钠肽(BNP)及β1肾上腺素能受体(AR-β1)的蛋白表达水平。 结果:心衰组和心衰去神经组小鼠sTAB术后第2、3、4周左心室射血分数(LVEF)逐渐减低,术后第4周心衰去神经组小鼠LVEF高于心衰组( P<0.05),而去神经组小鼠各时间点LVEF与对照组比较差异均无统计学意义( P均>0.05)。sTAB术后第4周HE染色结果显示,与对照组比较,去神经组小鼠心肌细胞横截面积差异无统计学意义( P>0.05),心衰组小鼠则较大( P<0.05),而心衰去神经组小鼠较心衰组小( P<0.05)。Masson染色结果显示,对照组和去神经组小鼠心肌组织几乎无蓝染,而心衰组小鼠心肌组织出现大量蓝染,心衰去神经组小鼠蓝染组织少于心衰组。免疫组织化学染色结果显示,去神经组小鼠TH阳性神经纤维密度与对照组比较差异无统计学意义( P>0.05),而心衰组小鼠心肌组织中可见大量TH阳性的神经纤维,心衰去神经组小鼠心肌组织中TH阳性神经纤维的密度较心衰组低( P<0.05)。Western blot结果显示,心衰组小鼠心肌组织中TH蛋白表达水平高于对照组( P<0.05),而心衰去神经组则低于心衰组( P<0.05),且TH蛋白在各组间表达的差异与BNP蛋白相似。与对照组比较,去神经组小鼠AR-β1蛋白表达水平差异无统计学意义( P>0.05),心衰组则较低( P<0.05),而心衰去神经组与心衰组该指标差异无统计学意义( P>0.05)。免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较,去神经组小鼠心脏CD68阳性细胞密度差异无统计学意义( P>0.05),心衰组则较高( P<0.05),而心衰去神经组较心衰组低( P<0.05)。 结论:切除双侧颈上神经节可减小心衰后小鼠心脏交感神经密度,减少巨噬细胞浸润,减轻心室重构,改善心功能。

3’,4’-二羟基黄酮醇通过抑制caspase1的活化减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚

目的探讨3’,4’-二羟基黄酮醇(DiOHF)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥厚的作用及其机制。方法选取7~8周龄雄性C57小鼠40只随机分为对照组(DMSO+生理盐水,n=10)、DiOHF组(6 mg·kg^(-1)·d^(-1),溶于10%DMSO+90%花生油,n=10)、AngⅡ组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1),溶于0.9%生理盐水,n=10)以及AngⅡ+DiOHF组(AngⅡ1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)+DiOHF 6 mg·kg^(-1)·d^(-1),n=10),各组注射不同试剂溶液4周后停止,使用心脏超声评价各组小鼠心功能。麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,称量体质量和心肺质量,取心尖组织进行PCR检测各组小鼠心肌纤维化基因结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白(Fn1)和炎症基因caspase1和IL-1βmRNA的表达。采用免疫印迹检测各组小鼠心尖组织cleaved caspase1和mature IL-1β蛋白的表达情况。其余组织固定包埋后取短轴最大径平面切片进行HE、Masson染色,评价心肌肥厚及纤维化。选取大鼠心肌细胞系(H9C2)分为DMSO、DiOHF(10μmol/L,溶于DMSO中)、AngⅡ(1μmol/L,溶于培养基中)、DiOHF+AngⅡ(10μmol/L DiOHF预处理2 h后加入1μmol/L AngⅡ共处理24 h)4组。24 h后对细胞骨架进行鬼笔环肽染色,在荧光显微镜下检测细胞形态,测量心肌细胞表面积。同时收获不同组细胞进行裂解后进行PCR检测caspase1和IL-1βmRNA的表达。采用免疫印迹检测各组细胞活化的cleaved caspase1、mature IL-1β和心肌肥厚相关蛋白脑钠肽(BNP)蛋白的表达情况。结果小鼠实验中,DiOHF的注射可减轻AngⅡ诱导的小鼠射血分数(EF)下降,降低心体质量比和心肺质量比(HW/BW、HW/LW)、心肌横截面积(CSA)和心肌胶原的沉积(均P<0.05)。RT-RCR显示与AngⅡ组相比,AngⅡ+DiOHF组Fn1、CTGF和炎症相关性基因caspase1、IL-1βmRNA的表达降低(均P<0.05)。免疫印迹显示AngⅡ+DiOHF组cleaved caspase1和mature IL-1β蛋白较AngⅡ组表达水平明显降低(0.77±0.09比1.18±0.14,0.90±0.13比1.56±0.30,均P<0.05)。H9C2细胞实验中,与AngⅡ组比较,AngⅡ+DiOHF组减少了细胞表面积,降低了caspase1和IL-1βmRNA的表达,减少了BNP和cleaved caspase1、mature IL-1β蛋白的表达(1.15±0.02比1.45±0.03,0.50±0.03比1.38±0.07,1.14±0.07比2.13±0.13,均P<0.05)。结论DiOHF通过抑制caspase1和IL-1β蛋白的激活,改善AngⅡ诱导的小鼠心脏肥厚和纤维化,保护小鼠心功能。

香草乙酮通过抑制CaMKⅡ活性保护压力负荷小鼠的心功能

目的:探讨香草乙酮(Apo)对压力负荷心衰小鼠心功能的保护作用以及机制。方法:48只C57BL/6雄性小鼠,随机分为sham、sham+Apo、TAC、TAC+Apo组,每组12只。采用主动脉缩窄术(TAC)构建压力负荷小鼠模型,术后3 d根据分组给予不同处理4周;利用小动物超声仪检测心功能各项指标的变化;苏木精-伊红(HE)染色和马松(Masson)染色观察各组小鼠心肌细胞横截面积(CSA)变化和心肌胶原容积分数(CVF);实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测心肌肥厚和心肌纤维化相关基因的变化;蛋白质印迹(Western Blot)法分析心肌组织中的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)及其磷酸化水平。结果:与sham组相比,TAC组小鼠的心功能下降,心肌细胞明显增大,纤维化程度增加,相关基因的mRNA水平明显上调,CaMKⅡ磷酸化水平显著升高。腹腔注射Apo后,能够改善压力负荷导致的心功能降低,CSA和CVF减小,相关基因的mRNA水平相对下降,CaMKⅡ磷酸化水平也明显下降。结论:Apo能够通过抑制CaMKⅡ活性和降低心室纤维化保护压力负荷心衰小鼠的心功能。