Lithocarols类化合物生物合成基因litI的表达及其启动子功能分析

【目的】Lithocarols为新型的多异戊烯基二苯甲酮类化合物,具有良好的抗肿瘤活性。对lithocarols生物合成基因litI进行克隆和表达纯化,并对该基因的启动子进行功能鉴定,为lithocarols的生物合成及转录调控奠定分子生物学基础。【方法】将litI基因扩增后进行原核表达,采用镍亲和层析初步纯化目的蛋白LitI,利用生物信息学方法分析该蛋白的性质和结构。同时扩增litI基因启动子片段,构建荧光素酶表达系统,分析启动子的转录活性,利用PlantCARE启动子分析网站对litI基因启动子的功能组件进行预测。【结果】LitI蛋白为亲水性蛋白,其相对分子量为51 kD,二级结构包括51.32%的α-螺旋、8.99%的延伸链、3.95%的β-转角以及35.75%无规则卷曲。litI基因启动子具有较强的转录活性且在大肠杆菌中具有启动氨苄青霉素抗性基因表达的功能,其功能组件包含TATA box和CAAT box。【结论】通过异源表达获得了LitI蛋白,分析了其性质和结构,并鉴定了具有较强转录活性的litI基因启动子片段。

巴戟天内生真菌Diaporthe lithocarpus的次级代谢产物及其细胞毒活性研究

目的:研究巴戟天内生真菌Diaporthe lithocarpus A740的次级代谢产物及其细胞毒活性。方法:采用正、反相硅胶柱、凝胶柱和高效液相等多种色谱技术对菌株A740的固体发酵产物进行分离纯化,并通过NMR、MS等波谱方法鉴定化合物结构,采用SRB法对得到的单体化合物进行细胞毒活性测试。结果:从菌株A740的发酵产物中分离纯化得到13个化合物,分别鉴定为:2⁃羟基苯乙酸乙酯(1)、4⁃(2⁃羟乙基)苯甲酸(2)、4⁃羟基苯乙酸乙酯(3)、4⁃甲基⁃5,6⁃二氢吡啶⁃2⁃酮(4)、(3R,4R)⁃cis⁃4⁃hydroxy⁃5⁃methylmellein(5)、viridianol 1(6)、5⁃羟基⁃7⁃甲氧基⁃4,6⁃二甲基⁃1⁃(3H)异苯并呋喃酮(7)、phomopene(8)、diaporisoindole B(9)、diaporisoindole A(10)、p⁃苯三醇(11)、异戊二烯基异苯并呋喃A(12)、lithocarin A(13)。结论:其中,化合物1~7为首次从Diaporthe属真菌中分离得到。化合物10、12和13对神经癌细胞(SF⁃268)、人乳腺癌细胞(MCF⁃7)、人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞株(A549)四株肿瘤细胞株具有细胞毒活性,其中化合物10对这四种肿瘤细胞株的IC50为23.96~35.19μmol/L。

广藿香内生真菌Daldinia eschscholtzii A630次级代谢产物及其细胞毒活性研究

采用色谱法从广藿香内生真菌Daldinia eschscholtzii发酵液中分离得到9个化合物,通过波谱数据分析分别鉴定为dihydrosphaerolone(1)、2,3-dihydro-5-hydroxy-2-methyl-4H-1-benzopyran-4-one(2)、6-hydroxymellein(3)、4,8-dihydroxy-1-tetralone(4)、8-methoxy-1-naphthol(5)、helicascolide A(6)、1-(2,6-dihydroxyphenyl)butan-1-one(7)、1-(2,6-dihydroxyphenyl)ethan-1-one(8)、diisobutyl phthalate(9),其中化合物5、9为首次从该属真菌中分离得到。细胞毒活性测试显示化合物6、7对肿瘤细胞SF-268、MCF-7、NCI-H460、Hep G-2具有较好的抑制活性,IC50值在16.52~28.42μmol/L之间。

Paramyrothecium roridum中单端孢霉烯毒素生物合成基因启动子的克隆和功能鉴定

利用染色体步移技术对植物内生真菌Paramyrothecium roridum中单端孢霉烯毒素的生物合成基因tri5、tri12启动子进行克隆,分别利用原核和真核表达系统以及荧光素酶表达系统对启动子核心区域进行鉴定,发现tri12的启动子片段12-f1对氨苄青霉素抗性基因和潮霉素抗性基因表达的启动效率最高,tri5的启动子片段5-f0对荧光素酶基因表达的启动效率最高;同时对启动子的功能组件进行分析,发现tri5含有TATA box和CAAT box,而tri12是TATA-less启动子,但含有CAAT box和GC box。本研究为强启动子的筛选及单端孢霉烯类化合物的高效生物合成奠定基础。

深海真菌Dichotomomyces cejpii胶霉毒素生物合成基因启动子的克隆和功能鉴定

利用染色体步移技术对深海真菌Dichotomomyces cejpii中胶霉毒素的生物合成基因Gli G、Gli I和Gli O启动子进行克隆,并将其核心区域导入p GL3-basic荧光素酶报告基因载体,通过荧光强度分析发现Gli G的启动子转录活性最强。进一步将Gli G启动子核心区域导入含潮霉素抗性标记的p AN7-1载体,以替换原有启动子pgpd A,并将重组质粒导入酿酒酵母,用潮霉素抗性平板进行筛选,发现Gli G启动子能在酿酒酵母中启动潮霉素抗性基因的表达。

春砂仁内生真菌Letendraea helminthicola A696的次级代谢产物研究

研究春砂仁内生真菌Letendraea helminthicola A696的次级代谢产物,采用硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、凝胶柱色谱及高效液相色谱等方法从该菌株的发酵液中分离得到8个化合物,通过理化性质及谱学数据分析,分别鉴定为11-hydroxyl tricinonoic acid(1)、3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸甲酯(2)、gibepyrone F(3)、gibepyrone D(4)、对羟基苯甲醛(5)、对甲氧基苯乙酸(6)、间羟基苯乙酸(7)、麦角甾醇(8),其中化合物1为新化合物,化合物2~8均为首次从Letendraea属真菌中分离得到。选取化合物1~5进行了抗菌和抗肿瘤活性试验,结果表明化合物1~5在100μg/mL浓度下均无抗菌和抗肿瘤活性。

一种新型酰基转移酶GPAT的克隆、表达与酶学性质研究

Lithocarpins为分离自海洋真菌Phomopsis lithocarpus的聚酮类新骨架化合物,具有开发成为新型抗肿瘤药物先导化合物的潜力。基于基因组测序和生物信息学分析预测了lithocarpins的生物合成基因簇,对其中的未知功能基因g7779进行扩增,并在大肠杆菌中进行表达,利用镍亲和层析柱进行纯化,通过质谱测序、生物信息学分析及酶活力检测等方法,对纯化的蛋白进行了功能分析。结果表明:基因g7779表达的蛋白是一个兼具较强的酰基转移酶活性和一定的谷丙转氨酶活性的新型双功能酶(glutamic-pyruvic transaminase-acyltransferase,GPAT),纯度达到98.6%。结构分析显示,该蛋白由326个氨基酸残基组成,其分子量为36 kD,其二级结构包括55.52%α-螺旋、29.45%无规则卷曲、9.82%延伸链和5.21%β-转角;酰基转移酶活性分析表明,GPAT对底物乙酰辅酶A的最适反应温度为35℃,当pH为7.0时酶活最高,在40℃时的热稳定性较好,在此温度下处理2 h后,残留酶活力仍大于80%,而在50℃下热稳定性较差,处理30 min后残留酶活力低于10%;其酶动力学常数Km=761.57μmol/L,最大反应速率Vmax=29370μmol/(mg·min)。研究结果将为后续阐明lithocarpins生物合成途径提供分子生物学依据。

Cytotoxic diaporindene and tenellone derivatives from the fungus Phomopsis lithocarpus

Nine new compounds,including five natural rarely-occurring 2,3-dihydro-1H-indene derivatives named diaporindenes E−I(1−5),and four new benzophenone analogues named tenellones J−M(6−9)were isolated from the deep-sea sediment-derived fungus Phomopsis lithocarpus FS508.All the structures for these new compounds were fully characterized on the basis of spectroscopic data,NMR spectra,and ECD calculation and single-crystal X-ray diffraction analysis.The potential anti-tumor activities of compounds 1−9 against four tumor cell lines SF-268,MCF-7,HepG-2,and A549 were evaluated using the SRB method.Compound 7 exhibited cytotoxic activity against the SF-268 cell line with an IC50 value of 11.36μmol·L^(−1).

深海真菌Phomopsis tersa的次级代谢产物及其细胞毒活性研究

目的研究深海真菌Phomopsis tersa FS441的次级代谢产物及其细胞毒活性。方法采用正、反相硅胶柱、凝胶柱和高效液相等多种色谱技术对菌株FS441的固体发酵产物进行分离纯化,并通过NMR、MS等波谱方法鉴定化合物结构,采用SRB法对得到的单体化合物进行细胞毒活性测试。结果从发酵物中分离纯化得到11个化合物,分别鉴定为:5α,8α-表二氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(1)、麦角甾醇(2)、12-hydroxydehydrobotrydienol(3)、5,6-二羟基-2,3,6-三甲基环己-2-烯酮(4)、1,2-二羟基-3,4-脱氢蒽酮(5)、(1S,2S,3S,4R)-3-氯-4-(2-羟基丙吡啶-2-基)-1-甲基环己烷-1,2-二醇(6)、(-)-5-methylmellein(7)、酪醇(8)、胸腺嘧啶核苷(9)、(R)-(+)-甘油1-9(Z),12(Z)-十八碳二烯酸酯(10)、亚油酸(11)。结论化合物3~6为首次从Phomopsis属分离得到,化合物1和2对SF-268、MCF-7、HepG-2和A5494种肿瘤细胞株具有较弱的细胞毒活性。