日本血吸虫二价DNA疫苗的免疫保护效果研究

目的 观察本课题组所构建日本血吸虫大陆株二价 DNA疫苗 VR10 12 - Sj GST- Sj31和VR10 12 - Sj GST- Sj32的免疫保护效果。方法 用纯化质粒免疫昆明鼠 :6 0只小鼠分为 5组 ,2个对照组的小鼠分别于股四头肌注射生理盐水 10 0μl或空质粒 VR10 12 10 0μg,3个实验组的小鼠则同法分别注射 VR10 12 - Sj GST、VR10 12 - Sj GST- Sj31和 VR10 12 - Sj GST- Sj32各 10 0 μg,每隔 3周免疫1次 ,共免疫 3次 ,以间接免疫荧光法观察 VR10 12 - Sj GST- Sj31、VR10 12 - Sj GST- Sj32在肌肉组织中的表达后 ,每只鼠经腹部感染 10条尾蚴 ,4 5 d后剖杀计数各小鼠成虫数及肝卵数 ,并用 EL ISA分析小鼠血清中的抗体。结果 EL ISA分析表明 ,第 3次免疫后小鼠出现特异性 Ig G抗体。与生理盐水组比较 ,3个实验组的减虫率分别为 33.90 %、33.90 %及 2 7.14 % (P <0 .0 1) ,减卵率分别为6 1.86 %、74 .88%及 6 8.87% (均为 P<0 .0 1) ,每雌肝减卵率分别为 4 4 .6 7%、5 9.4 0 %、5 4 .32 % (P<0 .0 1)。与 VR10 12 - Sj GST组相比 ,VR10 12 - Sj GST- Sj31和 VR10 12 - Sj GST- Sj32组的减卵率分别为34.19% (P<0 .0 1)、18.5 1% (P<0 .0 1) ,每雌肝减卵率为 2 6 .6 2 %、17.4 6 % (P<0 .0 1)。结论 DNA疫苗 VR10 12 -

噬菌体表达短肽模拟旋毛虫抗原表位及其抗血吸虫保护性免疫研究

目的 从噬菌体随机肽库中筛选出模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。 方法 以纯化的旋毛虫感染鼠血清IgG为配基 ,亲合筛选法富集特异性噬菌体 ,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ;混合噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染后第 4 5天剖杀小鼠 ,观察减虫和减卵效果。 结果 经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到了有效的富集 ,第三轮洗脱噬菌体的产量约为第一轮的 15 0倍。随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 1个克隆能与旋毛虫感染鼠血清IgG特异性反应。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率与减卵率分别为 4 2 8%与 6 6 3% (P <0 0 0 1)。 结论 利用噬菌体随机肽库技术可获得模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导明显的抗血吸虫的保护性免疫。

重组日本血吸虫铁蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

目的用重组日本血吸虫铁蛋白免疫小鼠，观察抗血吸虫的免疫保护作用。方法用重组的日本血吸虫铁蛋白（ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ）免疫小鼠，经皮下免疫 ３次，在第 ３次免疫后 ４周，经腹部感染日本血吸虫尾蚴４０条或５０条，４５ｄ后杀鼠，观察减虫效果。结果用ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ、ＩＬ－１２＋ ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｉｎ和 ＦＣＡ＋ ＧＭ－ＣＳＦ－ＳｊＦｅｒｒｉｔｌｎ免疫小鼠分别获得 ２２． ８６％、 ２５． ６３％和３９ ８１％的减虫率。结论本研究首次证明铁蛋白能诱导抗血吸虫病保护性免疫。

日本血吸虫rGST-Sj32蛋白免疫小鼠感染前后细胞因子水平的变化

目的 :为进一步探讨rGST Sj32保护性免疫机制。 方法 :用rGST Sj32加弗氏完全佐剂 (FCA)皮下免疫BALB/c小鼠。于免疫前 ,攻击感染前 (第 3次免疫后 2wk)以及攻击感染后10d、30d及 4 5d ,各剖杀免疫组与对照组小鼠 5只 ,取脾细胞培养 ,对体外培养的脾细胞诱生的细胞因子进行分析。结果 :用rSj32刺激体外培养的小鼠脾细胞时 ,第 3次免疫后2wk(即攻击感染前 )剖杀小鼠的脾细胞分泌IL 4、IL 5和IFN γ的水平与佐剂对照组相比较 ,均有不同程度的升高 ,分别为 ( 10 .2 1± 3.6 5 )ng/L (P >0 .0 5 )、( 19.89± 9.5 7)ng/L (P >0 .0 5 )、( 5 .0 9± 2 .5 1) μg/L (P <0 .0 1)。攻击感染后10d、30d及 4 5d ,对照组与免疫组IFN γ的水平未见升高 ;对照组IL 4和IL 5的水平随着感染时间的延长明显升高 ,免疫组升高不如对照组明显。结论 :rGST Sj32疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,可诱导以Th1类细胞因子为主的免疫应答 ;

日本血吸虫新基因SjF1的克隆、表达及免疫保护效果研究

目的 构建日本血吸虫中国大陆株SjF1原核表达重组质粒,并进行免疫保护效果测定。方法 用聚合酶链反应(PCR)法将SjF1基因从已剪切阳性克隆中扩增出来,克隆入原核表达载体pTWIN1上intein2的N端,经PCR和限制性酶切筛选阳性重组子。将阳性重组子转化大肠杆菌,在低温和低IPTG浓度下诱导表达可溶性重组融合蛋白。经鉴定后分别以FCA作佐剂经皮下免疫和以壳聚糖作佐剂经黏膜免疫昆明鼠,观察诱导产生的减虫和减卵效果。感染前采血和唾液用ELISA法检测抗体。结果 成功克隆并表达了rSjF1。rSjF1以FCA作佐剂经皮下免疫获得了29.92％的减虫率和51.08％的减卵率;rSjF1以壳聚糖作佐剂经滴鼻免疫获得了25.74％的减虫率和44.04％的减卵率。结论 获得了rSjF1,该蛋白以FCA作佐剂经皮下免疫和以壳聚糖作佐剂经黏膜免疫均能诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。

重组血吸虫GST-Sj31蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫组织蛋白酶 B(Sj31) b、c片段蛋白 ,并对表达产物进行免疫保护效果测定。方法 分别将重组质粒 p GEX- Sj31b,p GEX- Sj31c转化感受态大肠杆菌ER2 5 6 6 ,在 IPTG诱导下进行表达 ,表达产物 GST- Sj31b、GST- Sj31c蛋白分别免疫小鼠 ,免疫第 3次后进行攻击感染 ,观察其免疫保护效果。结果 在 IPTG诱导下 ,表达载体中的 Sj GST基因与重组 Sj31b和 Sj31c基因获得了高效融合表达 ,用这两种融合蛋白免疫小鼠 ,分别诱导产生了 2 2 .71%和 13.6 %的减虫率 ;减卵率分别为 5 4 .2 1%及 4 5 .0 1%。结论 重组质粒 p GEX- Sj31b,p GEX- Sj31c可在大肠杆菌中高效表达 ,表达的融合蛋白 GST- Sj31b能诱导小鼠产生一定程度的抗 Sj保护性免疫力 ,而 GST- Sj31c的减虫率为 13.6 %。

日本血吸虫成虫肠道内容物中金属蛋白酶的鉴定

目的 鉴定日本血吸虫成虫肠道内容物中的金属蛋白酶。 方法 以明胶作底物 ,利用明胶 SDS PAGE分离日本血吸虫成虫肠道内容物 ,将电泳后的凝胶于不同 pH缓冲液和酶抑制剂中进行孵育 ,对其中的金属蛋白酶进行分析和鉴定。 结果 日本血吸虫成虫肠道内容物中存在降解明胶的金属蛋白酶 ,其最适 pH值为 7～ 9。金属蛋白酶抑制剂EDTA抑制其活性。电泳分离获得有活性的酶蛋白 ,该酶是血吸虫感染血清识别的弱抗原。

核酸疫苗pcDNA3.1/SjTs-1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染保护力的研究

目的 探讨日本血吸虫核酸疫苗 pc DNA3.1/ Sj Ts- 1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力。方法 小鼠随机分为 5组 ,每组 12只 ,包括单磷脂 A(MPL)、pc DNA3.1、pc DNA3.1+MPL、pc DNA3.1/ Sj Ts- 1和 pc DNA3.1/ Sj Ts- 1+MPL 组。滴鼻免疫。第 3次免疫后 2周 ,每只经腹部感染 (40± 1)条尾蚴。 4 5 d宰杀动物 ,以观察减虫率和减卵率。在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血和收集粪便 ,EL ISA检测血清内特异性 Ig A和 Ig G及粪内 s Ig A水平。结果 pc DNA3.1/ Sj Ts- 1滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答 ,且疫苗加佐剂组诱导小鼠产生的抗体水平高于不加佐剂组。 pc DNA3.1/ Sj Ts- 1和 pc DNA3.1/ Sj Ts- 1加 MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为2 4 .98%和 2 5 .5 7% ,减卵率分别为 6 1.4 4 %和 6 4 .5 9%。两者的减虫率和减卵率差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 pc DNA3.1/ Sj Ts- 1滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗攻击感染的保护力。

佐剂FCA与Quil A对rGST-Sj32的免疫增强作用的比较

目的 比较弗氏完全佐剂 (FCA)与皂素的纯化物 Quil A的免疫增强作用 ,进一步提高重组抗原 r GST- Sj32的免疫效果。 方法 r GST- Sj32 +FCA或 Quil A免疫 NIH小鼠 3次 ,EL ISA法检测抗体水平 ,用减虫率及减卵率表示保护效果。 结果 与 PBS对照组比较 ,r GST- Sj32 +FCA免疫小鼠减虫率为 42 .9% ,每克肝卵 (L EPG)减少率 5 1.0 % ,每雌肝卵 (L EPF)减少率为 2 3.9% ,抗体滴度达 1∶ 2 5 6 0 0。r GST- Sj32 +Quil A免疫小鼠减虫率为 46 .0 % ,L EPG减少率39.4% ,L EPF减少率为 8.5 % ,抗体滴度达 1∶ 5 12 0 0。 结论 FCA和 Quil A均可增强 r GST- Sj32免疫小鼠的抗感染保护性免疫力 ;FCA亦可增强 r GST- Sj32诱导小鼠抗生殖免疫 ,Quil A无增强抗生殖免疫的作用。

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum,sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选,将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后,将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示,插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0.8-2.0 kb之间,选取其中4个经DNA测序分析,发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因,分别命名为sj-IB1和sj-Rho GTPase-like gene,并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子,这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。

日本血吸虫成虫组分抗原的分离及小鼠免疫试验

目的 分离日本血吸虫可溶性成虫抗原 (AWA)中的组分抗原 ,分析其诱导的抗血吸虫的免疫保护性。方法 电泳层析法分离日本血吸虫AWA中的组分抗原 ,计算各组分抗原的分子量 ,并分析其免疫学活性。将各组分抗原分别免疫小鼠 ,攻击感染日本血吸虫尾蚴 ,感染后 4 5d剖杀 ,观察各组分抗原的免疫保护效果。结果 采用电泳层析法分离获得多个组分抗原 ,选择收集其中 4个较纯的组分抗原 ,分子量分别为 5 2kD、6 3kD、6 7kD和 74kD ;其中 6 3kD和 6 7kD抗原与感染血清有强的反应 ,而 5 2kD和 74kD抗原则反应弱 ;4种组分抗原均与AWA的免疫血清反应。 6 3kD抗原诱导的免疫保护力水平较5 2kD、6 7kD和 74kD抗原好。结论 电泳层析法分离的 4个血吸虫组分抗原有良好的免疫原性 ,且 6 3kD抗原有一定的免疫保护性。

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及重组蛋白疫苗免疫保护机制初探

目的 初步探讨日本血吸虫中国大陆株pcDNA3 .1 SjRhoGTPaseDNA疫苗、重组蛋白疫苗以及联合疫苗免疫的保护机制。 方法 将 pcDNA3 .1 SjRhoGTPaseDNA疫苗、重组蛋白疫苗分别及联合疫苗免疫昆明鼠后 ,分不同时间采集血清 ,以ELISA法测定总抗体及IgG亚类。 结果 重组蛋白疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体效价较高 ,DNA疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体以IgG2a为主 ,重组蛋白疫苗诱导产生的抗体以IgG1为主。 结论 Sj RhoGTPase基因DNA疫苗及联合疫苗主要诱生Th1型细胞免疫应答 。

日本血吸虫成虫呕吐物的生化及免疫学特性分析

目的 分析日本血吸虫成虫呕吐物与感染血清的免疫反应性 ,寻找特异性的血吸虫病诊断抗原。方法 采用 SDS- PAGE和免疫印迹分析呕吐物的免疫反应性 ,过碘酸钠氧化处理以鉴定呕吐物的抗原决定簇的性质。结果 日本血吸虫成虫呕吐物中存在能被血吸虫感染血清识别的特异抗原 31/ 32、4 7、6 0 / 6 2 k Da蛋白及 6 7k Da蛋白 ;31/ 32 k Da蛋白和 6 7k Da蛋白的抗原表位为蛋白 ,而 4 7k Da蛋白和 6 0 / 6 2 k Da蛋白的抗原表位为糖基。结论 日本血吸虫成虫呕吐物中存在血吸虫感染血清识别的特异抗原 ,其中 31/ 32 k Da蛋白已报告可用于血吸虫病诊断 ,4 7k Da蛋白和 6 0 / 6 2k Da蛋白含糖基表位并具有潜在的诊断价值。

IL-12对日本血吸虫重组SjGST-Sj32蛋白保护性免疫效果的影响

为进一步提高重组 Sj GST- Sj32 (r Sj GST- Sj32 )的免疫保护作用 ,用 IL- 12作为佐剂进行免疫增强效果的观察。在 0、2、6周用 r Sj GST- Sj32经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染后 1、3、5、7、9d经腹腔注射佐剂 IL- 12 ,用减虫率及减卵率表示保护性免疫力。结果与 PBS对照组相比 ,r Sj GST- Sj32 /IL- 12组减虫率为 38.2 % (P<0 .0 1) ,每克肝卵数 (L EPG)减少率为 75 .1% (P<0 .0 1) ,每雌肝卵数 (L EPF)减少率为 72 .9% (P<0 .0 1) ;与单独注射 r Sj GST- Sj32组相比 ,r Sj GST- Sj32 /IL- 12组减虫率为 2 6 .8% (P<0 .0 5 ) ,L EPG减少率为 72 .5 % (P<0 .0 1) ,L EPF减少率为6 6 .2 % (P<0 .0 5 )。表明 IL- 12作为佐剂 ,可同时增强 r Sj GST- Sj32诱导小鼠产生的抗感染和抗生殖免疫保护力。

日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究

目的 克隆和表达日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)CAI基因 ,并对表达产物进行免疫保护效果测定 ,评价其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。 方法 将SjCAI基因亚克隆至pGEX 5X 3载体 ,转化入感受态大肠杆菌ER2 56 6 ,在异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导下进行表达 ,用表达产物免疫小鼠 ,并设分别注射等体积的弗氏完全佐剂和PBS的两组对照组 ,观察免疫保护效果。 结果 在IPTG诱导下 ,表达载体中的SjGST基因与重组的SjCAI基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达 ,将其免疫小鼠 ,诱导产生了 2 9.87%的减虫率和 6 3.71 %的减卵率。 结论 SjCAI基因亚克隆至pGEX 5X 3载体后可在大肠杆菌中高效表达 。

重组日本血吸虫胞质氨基肽酶粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染保护力的研究

目的 探讨重组日本血吸虫胞质氨基肽酶粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力。 方法 实验小鼠分成 4组 ,每组 11只 ,包括CTB、rSjGST2 6+CTB、rSjGST -CA +CTB滴鼻免疫组和PBS滴鼻免疫为对照组。在第 3次免疫后 2周 ,每只经腹部感染 (4 0± 1)条尾蚴。 45d宰杀动物 ,观察减虫率和减卵率。在初次免疫前和攻击感染前采集唾液和尾静脉采血 ,ELISA检测血清及唾液内特异抗体水平。 结果 血清特异IgA和IgG及唾液内sIgA水平升高。rSjGST -CA +CTB和rSjGST2 6+CTB滴鼻免疫组减虫率分别为 2 9 62 %和 3 1 5 5 %。每克肝减卵率分别为 45 0 0 %和63 3 4%。

日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的 筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法 以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果 筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论 筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。

核酸疫苗VR1012/Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的研究

目的 探讨日本血吸虫核酸疫苗VR10 12 /Sj3 1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力。 方法 将实验小鼠随机分为 5组 ,每组 12只。A组为单磷脂 (MPL)组 ,B组为VR10 12组 ,C组VR10 12 +MPL组 ,D组为VR10 12 /Sj3 1组 ,E组为VR10 12 /Sj 3 1+MPL组。滴鼻免疫。在第 3次免疫后 2周 ,每只鼠经腹部感染 40± 1条尾蚴 ,45d后宰杀 ,观察减虫率和减卵率。在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血并收集粪便 ,ELISA检测血清内特异性IgA、IgG及粪内sIgA水平。 结果 与对照组相比 ,VR10 12 /Sj 3 1及VR10 12 /Sj 3 1加MPL滴鼻免疫均可引起小鼠血清IgG、IgA和粪内sIgA升高 ,且VR10 12 /Sj 3 1加佐剂滴鼻免疫组抗体的增幅 >不加佐剂组。VR10 12 /Sj3 1和VR10 12 /Sj3 1加MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为 2 1.70 %和 2 8.82 % ,减卵率分别为 2 7.98%和 40 .72 %。二者的减虫率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,但减卵率后者显著高于前者 (P <0 .0 5 )。 结论 VR10 12 /Sj3 1滴鼻免疫可引起小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗攻击感染的免疫保护力。

Isolation and Characterization of 44.6 kDa Protein from Schistosoma japonicum Male Worm

Soluble male worm antigen of Schistosoma japonicum ( Sj ) was investigated for development of new vaccine candidate. SDS-PAGE and Western blotting were performed to compare the difference between soluble antigens from worms of different sex. Mice vaccination with the testing purified protein was followed by Sj cercariae challenge to detect the protective effect against Sj . Sixteen bands were seen for the soluble male worm antigen and 12 for the female worm. In addition, a distinct band of 44.6 kDa from the male worm antigen was observed, and its antigenicity was demonstrated by Western blotting. This 44.6 kDa protein could induce significant worm and egg reduction rate in mice (39.31%, 41.98%, P <0.001). In this study a 44.6 kDa protein was isolated and partially characterized. Its antigenicity, immunogenicity and the partial immune protection suggest its potential vaccine candidte against Sj .