美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P^(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p^(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p^(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p^(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p^(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p^(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p^(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。

美洲拟鲽抗冻蛋白基因在E.coli中表达的研究

本文阐述了美洲拟鲽抗冻蛋白基因在E.coli中表达的研究。用Hpa Ⅱ酶切pCT5质粒,分离出抗冻蛋白基因片段,再经Bal引酶、绿豆核酸酶处理,并连接上Bgl Ⅱ接头,插入到pORF-2表达质粒的BglⅡ位点上,筛选出正确插入方向的转化子,称pORF-AF。并对pORF-AF质粒作出部分限制性酶切图谱,测定出插入基因的DNA序列,同时用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测插入基因,在E.coli TK1046中的表达产物,发现在电泳图谱上有明显的融合蛋白带,分子量大于标准蛋白β-半乳糖苷酶是由大肠杆菌外膜蛋白F、抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总的菌体提取蛋白20％左右。