一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价

目的 对一种无需核酸提取纯化的寨卡病毒实时荧光定量反转录PCR检测方法的性能进行评价。方法 该检测方法基于实时荧光定量反转录PCR技术,样本处理采用病毒富集法:取100~200μL待测样本,加入112~224μL样本处理液Ⅰ,5~10μL样本处理液Ⅱ,混匀后进行离心富集(12 000 r/min,离心半径8.6 cm,离心5 min)。离心后弃上清液,加入20μL复溶缓冲液重悬沉淀;取10μL重悬液,加入50μL PCR反应液上机检测。从定量检测下限、交叉反应、抗干扰性、精密度方面评价该检测方法的性能。收集北京协和医院检验科临床样本(血清、尿液、唾液样本),随机选取约1/5构建寨卡病毒感染模拟临床样本,进一步评定该检测方法的性能。结果 该检测方法对MR766、ZKC2/2016毒株的检测下限均为10;半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose, TCID50)/mL;对17种常见虫媒病原体检测结果均为阴性,无交叉反应发生;潜在干扰物质胆红素(15 mg/L)、血红蛋白(100 mg/L)、甘油三酯(2000 mg/L)、IgG(37.5 g/L)和EDTA-Na;(2.5 g/L)对其检测结果无干扰;检测低、中、高浓度寨卡病毒的批次内和批次间Ct值变异系数均<10%,精密度良好。共收集344份北京协和医院检验科临床样本,其中构建寨卡病毒感染模拟临床样本73份。采用该检测方法对344份样本进行检测,结果均与实际相符,无假阳性和假阴性。结论 寨卡病毒简单富集后再检测的方法特异性高、重复性好,检测结果不受干扰物质的影响,检测下限满足临床需求,且操作简便,但应用效果仍需在真实临床样本中进一步验证。

2018-2021年中国发热伴血小板减少综合征流行特征分析

目的分析我国发热伴血小板减少综合征(SFTS)流行现状及趋势。方法采集中国疾病预防控制信息系统2018-2021年全国SFTS病例数据,采用Excel 2016、Joinpoint 5.0.2、SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0等软件进行统计学和描述流行病学分析,尤其重点省份按月报告SFTS病例情况。结果2018-2021年,全国共有25个省份累计报告病例8835例,年报告发病率呈上升趋势,病例具有一定的区域聚集性,但以散发为主,报告病例数自3月开始逐渐增多,主要集中在4-10月(96.79%,8551/8835),一般在5-7月达高峰;人群分布以中老年农民为主,女性略多于男性,平均病死率为5.38%,不同地区差异较大,病死率随年龄增长而增加。结论2018-2021年,我国SFTS流行特征虽维持稳定,但报告病例数逐渐增多,分布范围呈扩大趋势,应予以关注。

基于慢病毒包装和CRISPR技术建立病毒感染关键基因CLTC敲除细胞系

网格蛋白是病毒进入内体系统时的关键蛋白,同时还可能参与病毒的胞内转运,目前该蛋白的具体作用范围报道还不一致。为了构建网格蛋白重链基因敲除细胞系,以研究其在病毒感染过程中的功能,本研究基于CRISPR/Cas9系统,首先通过包装慢病毒建立网格蛋白重链基因特异性打靶载体,使用嘌呤霉素对慢病毒感染的Huh7细胞进行阳性筛选,利用96孔板梯度稀释法获得单克隆细胞,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白,利用Western Blot实验进行蛋白敲除验证,最后进行细胞增殖活性检测和脱靶效应评估。最终本研究获得了一株网格蛋白重链基因敲除Huh7细胞系;通过脱靶效应评估,显示最可能的10个脱靶位点均不存在脱靶现象,且该基因敲除不影响细胞增殖活性。本研究成功构建了一株网格蛋白重链基因敲除Huh7细胞系,为研究网格蛋白在病毒进入宿主细胞时的功能建立了细胞模型。

rViRAL:几种常见呼吸道病毒感染宿主应答的基因表达交互查询系统

建立操作便捷、用户友好的在线系统可以实现对海量病毒感染宿主应答数据的深度挖掘,促进对病毒与宿主相互作用的深入了解。通过收录整合1483份批量转录组和超30000个细胞的单细胞转录组数据,以R语言为核心,整合多种先进生物信息工具,设计开发用户友好的在线平台rViRAL(Respiratory Virus Response interActive anaLysis)。在rViRAL上,研究人员通过用户友好的交互界面即可实现对感染后宿主应答的系列分析,包括:差异表达分析、诊断性能评价以及单细胞层面上的分子变化等。此外,rViRAL还提供跨多种常见呼吸道病毒感染类型,对感兴趣的基因进行泛感染比较分析的功能。借助rViRAL,生物学家可以无需任何计算编程技能就可以对感兴趣的基因进行假设探索与验证,这将极大地促进呼吸道病毒感染免疫的数据挖掘、科学讨论和治疗及诊断靶点的发现。

2004-2021年中国肾综合征出血热报告病例流行病学特征分析

目的分析我国近年来肾综合征出血热(HFRS)报告病例流行特征,加强对该病流行现状的理解。方法从全国疾病监测信息报告管理系统获得2004—2021年HFRS病例信息,描述分析其分布动态变化特征以及病例诊断情况。结果2004—2021年全国31个省(自治区、直辖市)都有病例报告,HFRS发病总体呈下降趋势,累计报告病例224396例,死亡2068例,年均发病率约为0.93/10万,病死率0.92%。病例呈高度分散又相对集中的分布特征,发病数前10位的省份报告发病185207例,占全国总报告病例数的82.54%。发病呈春夏季峰(4—7月)、秋冬季峰(10月至次年1月)季两个发病高峰,春夏季以5月或6月为高峰,11月或12月是秋冬季发病高峰,春夏季峰占32.20%,秋冬季峰占47.85%,秋冬季峰明显高于春夏季峰。男女性病例性别比为2.93∶1,55岁以上人群发病率呈明显上升趋势,30~45岁人群发病率明显下降,14岁以下儿童病例占比出现上升趋势。职业分布仍以农民为主(占67.74%),待业和居家人群病例占比出现明显上升。结论2004—2021年,中国HFRS报告病例数逐步下降到相对低位水平,伴随局部地区发病率的显著起伏;疫情分布地域扩大,部分地区出现再发疫情;高龄人群和儿童病例占比有升高趋势,应引起关注,并制定针对性的策略和措施。

抗SARS-CoV-2 S蛋白IgM单克隆抗体的表达及鉴定

为了寻求SARS-CoV-2 IgM抗体阳性血清质控品的替代品,本研究成功表达纯化出抗SARS-CoV-2 S蛋白IgM单克隆抗体。研究确定了IgM单克隆抗体最佳表达载体为含增强子sp163和信号肽2的组合以及第5d为目的蛋白收获的最佳时间。此外在研究J链的作用时发现转染细胞时不添加J链(nCoV-163-IgM3)的表达量明显高于添加J链(nCoV-163-IgM3 J)时的表达量,J链对蛋白稳定性也无明显影响,且nCoV-163-IgM3和nCoV-163-IgM3 J抗原结合活性之间的差别无统计学意义(P>0.05),nCoV-163-IgM3和nCoV-163-IgM3 J对本研究所检测的WTS1、Alpha-S1、Beta-S1、Delta-S1、Omicron-S1、BA.2-S1、BF.7-RBD、XBB.1-S1、BQ1.1-S1等九种抗原均有结合活性,只有一株(BA.2.75-RBD)逃逸。纯化后的目的蛋白经还原剂(β-ME)还原后显示重链分子量大小为70kD左右,轻链分子量大小为25kD左右。目的蛋白均可与新型冠状病毒抗体检测试剂盒(胶体金,INNOVITA)、SARS-CoV-2 S蛋白IgM抗体酶联免疫吸附测定试剂盒(Elabscience)、抗SARS-CoV-2 S-RBD蛋白人IgM抗体酶联免疫吸附测定试剂盒(Proteintech)等三种试剂盒反应。

七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术的初步建立

由呼吸道病毒引起的疾病严重威胁着人类的生命健康,为了建立一种快速高通量的呼吸道病毒核酸检测方法,本研究将多重PCR技术同液相芯片技术结合起来,针对呼吸道合胞病毒A型和B型、乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系、甲型流感病毒H1型和H3型以及新冠病毒等常见的七种呼吸道病毒,初步建立了七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术,评价了方法的特异性、敏感性和重复性,并使用来自安徽省疾控的25份临床急性期样本核酸对方法进行验证。结果显示,建立起的基于液相芯片多重核酸检测方法可特异性识别七种目标呼吸道病毒的靶基因序列,与包括副流感病毒在内的9种非目标呼吸道病毒无交叉反应。对七种病毒核酸进行十倍稀释液相检测,其中H3、BV、RSVB可以检出102拷贝/μL,BY、RSVA和SARS-CoV-2可以检出103拷贝/μL,对H1的检测限为104拷贝/μL。25份样本核酸检测结果与实际相符。结果表明,本研究建立的七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术具有特异性强、敏感性高、稳定性好等特点,可用于临床样本的快速检测,为呼吸道类传染病的液相芯片诊断奠定了实验室基础。

发热伴血小板减少综合征病毒在不同环境条件下的稳定性研究

为评估发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)在环境中的稳定性,本研究比较分析了实验室制备的SFTSV在不同介质表面的稳定性以及温度、自然通风干燥和常用酒精消毒剂等因素对其生存能力的影响。不同时间点收获的病毒样本,通过接种于Vero细胞中传代培养、空斑试验和实时荧光定量RT-PCR等方法测定病毒的感染性、滴度和复制培养过程中的动态变化。结果显示,在室温(约25℃)自然通风干燥条件下,不同介质表面的SFTSV感染性快速下降,在硬币、塑料等介质表面的病毒感染性可维持24 h,但病毒感染性滴度24 h内显著下降分别约10^(4.46)倍和10^(4.6)倍,在无纺布和纸张表面的病毒感染性滴度在6 h内就下降分别约10^(3.82)倍和10^(4.12)倍。如果将SFTSV置于密闭湿润环境中,病毒感染性可维持长时间的稳定性,24 h病毒感染性滴度下降不明显,1周内下降约10^(1.49)倍,在3周时仍可通过细胞培养分离到感染性病毒颗粒,4周后失去了感染性;而SFTSV处于4℃时,感染性保持相对稳定性,在4周后,病毒感染性滴度下降仅约10^(2.09)倍,可通过细胞分离培养扩增病毒。使用酒精消毒剂对物体表面消毒时受SFTSV在物体表面的状态影响,当病毒处于干燥状态时,喷洒70%酒精可灭活病毒,如果处于湿润状态则不能有效灭活病毒。本研究比较研究了不同环境条件下SFTSV的稳定性,显示了环境材料性质、自然通风干燥程度、温度对SFTSV感染性的影响,有助于增进对SFTSV接触传播风险的理解,为完善SFTSV防控措施提供了参考依据。

139名跨境工作人员淋巴脉络丛脑膜炎病毒和汉坦病毒感染调查分析

目的调查跨境务工人员经鼠传播淋巴脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV )和汉坦病毒(hantavirus, HV)的感染状况, 初步评估鼠传病毒感染风险。方法本研究于2019—2020年间, 针对常年在境外从事户外工程工作的务工人员开展调查, 采集血清样本, 通过基于LCMV重组核蛋白的间接ELISA方法、免疫印迹法和基于LCMV重组糖蛋白的间接免疫荧光法检测样品血清中LCMV特异性IgG抗体, 采用检测汉坦病毒IgG抗体的商业化ELISA试剂盒和汉坦病毒感染抗原片检测血清中HV IgG抗体情况。结果共调查了139名跨境工作者, 年龄在25~57岁之间, 64%(89/139)有多个国家工作经历, 涉及26个国家, 包括14个亚洲国家和12个非洲国家, LCMV IgG抗体检出率11.51%(16/139), 阳性样本经免疫印迹法和间接免疫荧光法核实, 抗体检出率略高于类似调查中发现的人群感染率;HV抗体检出率0.72%(1/139), 但尚不能确定获得感染的时间和地区。结论本研究揭示了境外务工人员中LCMV和HV病毒感染状况和存在风险, 提示户外工程场所加强鼠传疾病防控的必要性。

基于Luminex平台的非洲流行的病毒性出血热IgG抗体多重检测方法的初步建立

目的初步建立针对非洲流行的病毒性出血热IgG抗体的多重检测方法。方法重组表达并纯化非洲常见的出血热病毒抗原，将抗原偶联至荧光微球，单重检测兔血清IgG抗体评价偶联效果，多重检测从非洲入境的发热人员出血热病毒IgG抗体，并与ELISA方法比较，使用SPSS进行卡方检验和一致性分析。结果重组表达纯化的出血热病毒抗原的纯度和浓度均达到偶联和检测要求。各重组抗原与相应荧光微球偶联有效，多重检测78份非洲入境发热人员血清样本，共检出1份拉沙热IgG抗体阳性、1份卢约病毒IgG抗体阳性，4份登革病毒IgG抗体阳性，6份黄热病毒IgG抗体阳性。与ELISA方法相比较结果无明显统计学差异，且两种方法具有高度相关性。结论初步建立了基于Luminex高通量检测平台的针对非洲流行的病毒性出血热IgG抗体多重检测方法，为实现鉴别诊断提供了实验基础。

寨卡病毒感染者血液、尿液和唾液中IgA抗体水平初步研究

为研究寨卡病毒（ZIKV）感染者血清、尿液和唾液样本中特异性IgA抗体水平,进一步了解ZIKV感染免疫机制,本研究重组表达制备寨卡病毒NS1蛋白,对其浓度、纯度进行鉴定,初步评估了NS1蛋白抗原性,并建立间接酶联免疫（Indirect-ELISA）方法,检测患者临床血清、尿液和唾液样本中的寨卡特异性IgA抗体。利用健康人群血清、尿液和唾液标本,评估检测方法的特异性,并确定以阴性对照的均值加3倍标准差作为判定检测结果的阈值,特异性为100%。对经病毒核酸检测所确诊病例的33份血清样本、4份尿液样本和3份唾液样本进行检测。选择3份具有较高IgA抗体水平的血清,通过2倍系列稀释的方法评价了血清样本中特异性IgA抗体的滴度,可有效检出经3 200倍以上稀释的血清样本中的IgA抗体。重复性检测实验显示板间变异系数为（3.0±0.8）%,板内变异系数为（2.7±1.0）%。寨卡患者血清、尿液和唾液样本中的特异性IgA抗体的检出率分别为75.8%（25/33）、100%（4/4）和33.3%（1/3）,提示IgA抗体在3种体液标本中均具有显著的存在,具有充当体外诊断指标的意义。同时尿液、唾液标本中特异性IgA抗体的存在,提示潜在的粘膜免疫效应,有助于增强对病毒体内播散和体外传播的理解,也初步提示了寨卡病毒NS1蛋白可用于相关免疫学诊断试剂的研发。

基于CRISPR/cas9文库筛选的慢病毒库包装方法研究

目的探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒配比、不同收毒时间以及不同量的Lipofectamine 3000 reagent包装出的慢病毒滴度进行检测,最后通过高通量测序技术评价慢病毒库的sgRNA(single guide RNA,单链引导RNA)覆盖度和reads数分布。结果当质粒配比psPAX2∶pMD2.0G∶Lentivirus library=2∶1∶1时,慢病毒滴度较高;当加入Lipofectamine 3000 reagent的量为10 μl时,慢病毒滴度较高。两种情况,RT-PCR和ELISA法结果一致。免疫荧光显示,收毒时间为60 h时慢病毒滴度较高。经Ion Torrent高通量测序,按照本研究的最优条件包装出的慢病毒库覆盖度达99.3%,sgRNA的reads数符合正态分布。结论本研究探索了慢病毒库包装的优化条件,为下一步CRISPR/cas9文库筛选提供保证。

基于CRISPR/Cas9系统建立SNX11基因敲除A549细胞系

为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白后利用Western Blot方法进行蛋白敲除验证,最后进行细胞活性检测和脱靶效应评估。最后,本研究获得了一株SNX11基因敲除A549细胞系;通过脱靶效应评估,结果显示最可能的20个脱靶位点均不存在脱靶现象;该基因敲除对细胞增殖活性没有影响。本研究成功构建了一株SNX11基因敲除A549细胞系,为SNX11蛋白的功能研究建立了细胞模型。

人源抗寨卡病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

目的 利用噬菌体表面展示技术进行人源抗寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)噬菌体抗体库的构建及其基因工程单克隆抗体Fab段基因的获得和表达,掌握人源噬菌体抗体库的制备和针对特定病毒高度特异性的抗体筛选方法。方法 收集寨卡病毒病康复期患者的全血样本,分离淋巴细胞,采用RT-PCR方法成功地从淋巴细胞Ig mRNA中扩增出抗体轻链和重链Fab段基因,利用pComb3H系统成功构建具有基因多样性的人源抗ZIKV噬菌体抗体库制备。利用已纯化的ZIKV和已获得的ZIKV E蛋白抗原对已建立的抗体库进行富集筛选。结果 本研究成功地构建人源抗ZIKV噬菌体抗体库,并获得针对ZIKV E蛋白抗原的单克隆抗体Fab段基因,该基因能在大肠埃希菌中进行有效表达。结论 根据其序列分析研究表明,该单抗为一株新的抗ZIKV的人源基因工程抗体,这对建立ZIKV快速特异的早期诊断方法,获得特异性ZIKV人源治疗单抗奠定基础。

SFTSV感染周期和抗病毒药物的研究进展

发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是一种蜱传的新型布尼亚病毒,在中国大别山地区被首次发现,临床上可以引起严重发热、血小板减少等症状,致死率可达10%~30%。目前,SFTSV的致病机理和感染机制尚不清楚,还没有针对该病毒的特效药物和疫苗。本文对SFTSV的入胞机制、膜融合、复制、装配和出芽过程进行了综述,总结了目前SFTSV相关的治疗性抗体和抗病毒药物的研究进展,以期为我国SFTSV的疫苗和抗病毒药物的研发提供参考。

啮齿类动物中汉坦病毒感染血清学和病原学检测方法比较研究

致病性汉坦病毒的宿主主要为啮齿类动物,其病毒感染状况是人间疫情发生的关键影响因素,可通过检测宿主动物标本中病毒基因组RNA、蛋白抗原及特异性抗体而进行监测。本研究利用367份鼠肺及鼠血标本,对双抗原夹心ELISA(ELISA)、实时荧光RT-PCR(RT-PCR)和免疫荧光(IFA)等三种分别检测抗体、核酸和抗原的方法进行比较评估。ELISA法检出抗体阳性鼠血标本46份,阳性率为12.53%;RT-PCR法检出病毒RNA阳性鼠肺标本28份,阳性率为7.63%;IFA检出抗原阳性鼠肺标本24份,阳性率为6.54%。宿主动物组织标本中检出汉坦病毒RNA和(或)结构蛋白抗原的标本,对应的血液标本中可检出病毒特异性抗体,100%(24/24)IFA检测阳性标本和89.3%(25/28)RT-PCR检测阳性标本对应血标本ELISA抗体检测阳性,反之亦然,检出抗体的标本基本包含了可检出抗原和RNA的标本。RT-PCR与IFA检测结果差异无显著性(χa2=0.64,P>0.05),一致性检验Kappa系数为0.71,一致性高(Z=13.66,P<0.05),首先对血标本开展基于ELISA的特异性抗体检测,可显著缩小RT-PCR或IFA法检测病毒RNA或抗原的范围(χb2=12.04,χc2=20.05,P<0.05)。本研究为宿主动物汉坦病毒感染实验室监测方案优化提供了有益的依据。

北美洲流行汉坦病毒多重荧光定量RT⁃PCR检测方法的建立

为了建立牛轭湖病毒(Bayou virus,BAYV)、纽约病毒(New York virus,NYV)、厄尼诺洛峡谷病毒(El Moro Canyon virus,ELMCV)以及岛景病毒(Isla Vista virus,ISLAV)四种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术,本研究选用上述四种病毒的N蛋白基因作为靶标区域设计四组特异性引物探针,建立四重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用四种病毒体外转录RNA进行灵敏度和重复性验证,并使用其他病毒细胞培养物及体外转录RNA进行特异性验证。结果显示,四重实时荧光定量PCR扩增效率均可达到95%以上,四种病毒体外转录RNA灵敏度介于1~10拷贝/μL,与单重检测方法无明显差异,且与其他病毒无交叉反应。稳定性评价结果显示,批内、批间变异系数均在3%以内。本研究所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于相关样本的诊断与筛查。

Flexal和Whitewater Arroyo两种高致病沙粒病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

Flexal病毒(Flexal virus,FLEV)和Whitewater Arroyo病毒(Whitewater Arroyo virus,WWAV)属沙粒病毒,经鼠传播,可引起人类严重传染病,主要分布于美洲,有因野外工程而感染或国际物流和人员往来而输入的风险。本研究通过检索、分析FLEV和WWAV基因组序列,参照同科属病毒遗传进化特征,确定病毒基因组保守区,筛选分子检测靶基因,设计PCR扩增引物和检测探针,建立两种沙粒病毒的实时荧光RT-PCR检测方法,并进行灵敏性、特异性和重复性初步评价。结果表明,所建立的FLEV和WWAV检测方法与其他病毒无交叉反应,扩增效率大于95%,检出限分别为100copies/μL和20copies/μL,变异系数在2%以内。上述结果显示,本研究所建立的FLEV和WWAV检测方法的特异性强,灵敏性与重复性均处于常规病毒性传染病分子诊断可接受范围,可应用于疑似病例的快速检测和相关病原的筛查和流行病学调查。

寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒微流控荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

目的结合微流控与荧光定量RT-PCR技术建立寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、黄热病毒(yellow fever virus,YFV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的快速核酸检测方法,以实现这4种病毒感染的快速诊断。方法以ZIKV的NS1基因、DENV和YFV的NS5基因以及CHIKV的E1基因作为靶序列设计4组特异性引物探针;用体外转录RNA评价方法的灵敏性;用其他病毒核酸评价方法的特异性;ZIKV、YFV、CHIKV检测方法采用模拟阳性样本,DENV检测方法采用临床患者标本进行验证,并与传统荧光定量RT-PCR检测方法进行比较。结果ZIKV、DENV、YFV、CHIKV4种方法的最低检出限分别是14.57拷贝/μl、94.27拷贝/μl、8.25拷贝/μl、223.19拷贝/μl;4种检测方法与其他病毒核酸无交叉反应;ZIKV、YFV、CHIKV模拟阳性样本检出率为100%,各浓度检测Ct值的变异系数均在2%左右;20份DENV临床患者标本检出率为100%,与传统荧光定量RT-PCR检测方法结果一致。结论本研究建立的ZIKV、DENV、YFV、CHIKV微流控荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性、稳定性,25 min内即可完成1次检测,可适用于现场实验室检测与早期诊断。

琉球病毒、索尔韦齐病毒、苏里斯病毒等三种沙粒病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

建立可检测琉球病毒(Ryukyu virus,RYKV),索尔韦齐病毒(Solwezi virus,SOLV)以及苏里斯病毒(Souris virus,SOUV)等三种沙粒病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法。分析三种病毒流行病学分布特征,从国际公共数据库搜索下载基因组序列,进行比对分析,确定检测靶标,借助primer premier 6.0生物信息学软件,设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,利用化学合成和体外转录方法制备模拟样本,比较评价三种方法的检测限、特异性、重复性特征。所建实时荧光定量RT-PCR检测方法均可有效扩增检测病毒RNA靶标,检测限分别为40拷贝/μL、7拷贝/μL和15拷贝/μL,检测汉城病毒、汉滩病毒、登革病毒Ⅰ~Ⅳ型分离株、发热伴血小板减少综合病毒及30份健康人血清样本无非特异性扩增,三种病毒相互间以及其他8种出血热相关沙粒病毒RNA间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数均在2%以内。本研究建立的检测RYKV、SOLV和SOUV三种沙粒病毒的实时荧光RT-PCR方法具备用于相关疑似感染者临床样本、宿主动物标本以及进出口物品的筛查检测的潜力,但因未经基于实际病毒感染样本的比较评价,检测结果的解释仍具有一定的局限性。