杉木ClOFP1基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

OFP基因家族在植物的生长发育中发挥重要调控作用。为探究ClOFP1在木质部形成过程中的作用,本研究通过克隆杉木ClOFP1基因,分析其表达模式,并开展该基因在杉木群体的单核苷酸多态性(SNP)及连锁不平衡(LD)分析。结果表明,ClOFP1基因的cDNA序列长1 648 bp,开放阅读框(ORF)长1 320 bp,在氨基酸序列的376~428位有卵形蛋白家族特有的OVATE结构域。系统进化树分析结果显示,ClOFP1蛋白与水稻、拟南芥中调控细胞伸长和次生壁形成的OsOFP19、AtOFP1、AtOFP4聚为一类。ClOFP1在幼嫩叶片和茎段中优势表达,随着叶片成熟和茎段木质化程度加深其表达量递减,幼叶中的表达量是老叶中的14倍。同时,在杉木木材中,ClOFP1主要在靠近树皮的边材区域表达,而在心边过渡区表达较弱。推测ClOFP1基因作为负调控因子,参与次生木质部的形成。共检测到ClOFP1基因内存在16个常见SNP位点,平均发生频率为1/103 bp。其中编码区域有11个SNP位点,分为7个同义突变和4个错义突变。7个地理种源的SNP多样性指数差异不显著,非同义突变多样性π_(ns)小于同义突变π_(s)。连锁不平衡分析结果发现,ClOFP1基因间的LD在875 bp左右长度内迅速消失,且SNPs具有3个较强的连锁不平衡区块。综上,ClOFP1的表达与杉木茎段木质化程度负相关,ClOFP1在不同无性系中SNP变异较为丰富,位点间的LD在较短序列长度内迅速消失,表明基于该基因的LD作图是可行的。本研究结果为深入解析ClOFP1功能和开展LD作图提供了重要依据。

发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化

闽楠[Phoebe bournei(Hemsl.)Yang]为我国重要的珍贵树种。为建立闽楠遗传转化体系,以闽楠幼苗为材料,利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上,进一步利用正交[L9(3^(3))]试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。另外,对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。结果表明,注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为80.0%、66.7%;而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。正交试验中,影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。最大诱导率和转化效率分别达到了87.5%、70.6%。该体系的最优组合为:K599菌株在菌液浓度OD_(600)=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。此外,较弱光强(50μmol·m^(-2)·s^(-1))的培养条件比较强光照(100μmol·m^(-2)·s^(-1))更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系,成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株,为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。

云锦杜鹃转录组分析

云锦杜鹃Rhododendron fortunei具有很高的园艺观赏价值。由于缺乏相关的遗传信息,云锦杜鹃的多样性、分子辅助育种等工作进展较为缓慢。通过高通量测序技术(Illumina),对云锦杜鹃的转录组进行了测定和分析。通过测序拼接和去冗余共获得84 633条单基因簇(unigene)序列,平均长度为691.4 bp。通过与公共数据库比对成功注释到了35 526条单基因簇,其中与葡萄Vitis vinifera基因相似的序列最多。根据基因本体论数据库(GO)可将23 215个单基因簇归类于生物学过程、细胞组分及分子功能等三大类的55个功能组;真核直系同源基因数据库(KOG)将11 085条单基因簇分为26个功能分类,涉及一般功能预测的单基因簇最多,多达1 970条;以京都基因与基金组百科全书(KEGG)作为参考,依据代谢途径可将9 887个单基因簇定位到272个代谢通路。进一步分析基因注释结果,挖掘获得24个编码MADS-box基因的单基因簇分属于10个不同亚家族。此外,检测到了21 900个简单序列重复(SSR)位点,可用于SSR标记开发。

光皮桦MYB基因的克隆及表达和调控分析

【目的】MYB转录因子是植物中一类重要的转录因子,在调控次生壁纤维素和木质素等的合成中具有重要作用。为了挖掘参与光皮桦木材形成的MYB基因,本研究通过克隆MYB基因,分析其序列特征、表达模式和下游调控基因,以期为后续功能深入解析和分子辅助育种提供理论依据和基因资源。【方法】利用RACE技术分离到4个光皮桦BlMYB基因的cDNA片段。利用生物信息学工具对这些基因的序列特征进行分析,利用实时荧光定量PCR分析BlMYB及预测的下游基因在不同器官(雌花序、雄花序、嫩芽、嫩叶、成熟叶、茎)、组织(内外层木质部、韧皮部、形成层)中,以及应拉木诱导早期阶段的表达差异。以2个木质部特异表达的BlMYB为指导基因,采用相互排名法和Cytoscape软件构建共表达网;使用Plant CARE在线查询共表达的下游基因启动子区元件。【结果】分离到4个BlMYB的全长cDNA序列,分别命名为BlMYB1、BlMYB2、BlMYB3和BlMYB4,它们编码的蛋白分别由395、252、258、320个氨基酸残基组成,且在靠近N端都有R2R3结构域。4个BlMYB氨基酸序列间一致性27%～37%,而与它们同源的拟南芥AtMYB氨基酸序列间的一致性为39%～55%。4个BlMYB基因都含有1～2个内含子。进化树构建分析发现4个BlMYB分属于4个不同的分支,其中BlMYB2、BlMYB4分别与细胞次生壁形成相关的MYB聚在一起。BlMYB1、BlMYB3在成熟叶片中优势表达,且随叶片成熟表达水平呈递增趋势,可能与叶片的发育有关。BlMYB2在木质化茎段的木质部强烈表达,而在叶片、韧皮部等组织中的表达相对较弱;在应拉木诱导形成的早期阶段,应拉木中BlMYB2呈下调表达,尤其是拉弯处理48 h和7天时的相应数值均显著低于直立木。BlMYB4在茎的木质部、成熟雄花序中优势表达,在根、嫩叶中的表达水平较低;同时,在应拉木诱导形成早期阶段,BlMYB4在应拉木和对应木中分别呈现上调和下调表达。另外,基于共表达分析和特异性AC元件筛选,推测FRK、COMT、HCT、CesA3、CesA4、4CL、CCoAOMT 7个纤维素、木质素合成酶基因可能受BlMYB2和BlMYB4所调控。【结论】获得的4个光皮桦BlMYB基因属于R2R3-MYB家族,具不同的基因结构。4个基因呈现不同的表达模式暗示它们可能参与调控不同代谢途径。结合光皮桦应拉木特征和共表达分析结果,可初步推测BlMYB2和BlMYB4可能参与光皮桦木材形成过程的调控。

3种杉木种子活力测定方法比较

【目的】建立一种快速简便的杉木Cunninghamia laneolata种子活力测定方法。【方法】以3个不同品种杉木种子为材料,以标准发芽法为参照,比较四氮唑法(TTC)和紫外分光光度计法(UVS)测定种子活力时的准确性和便捷性。【结果】标准发芽法测定种子活力最为准确,但耗费时间长,难以开展大批量测定;TTC法测定杉木种子活力准确度不稳定,且操作繁琐;UVS法的测定值与真实萌发率比较接近,有较高可信度,且操作简便。【结论】UVS法可作为快速测定杉木种子活力的优选方法。

杉木NAC转录因子基因ClNAC1的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

【目的】克隆与杉木次生壁形成相关的Cl NAC1基因,在组织表达特异性分析基础上开展该基因的单核苷酸多态性(SNP)及其连锁不平衡(LD)分析,以期为深入解析该基因功能和开展LD作图提供重要依据。【方法】基于杉木根、茎、叶等混合样本转录组测序获得的相关数据,分离杉木Cl NAC1的c DNA序列,进行同源比对和进化树构建分析。利用实时荧光定量PCR技术(q PCR)检测Cl NAC1的表达模式。通过MEGA 6.0和Dna SP 5.0分析Cl NAC1在40个杉木无性系的SNP变异,以及LD衰减程度。【结果】分离到Cl NAC1基因c DNA序列1 286 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 092 bp,编码蛋白质在N端含有1个由128个氨基酸残基组成的NAC结构域。相应基因组序列长2 546 bp,有3个外显子和3个内含子,且第1个内含子位于5'非翻译区(UTR)。系统进化树分析表明,Cl NAC1蛋白位于B分支,与拟南芥的NST1/2/3、毛果杨的Ptr WND2A/B等聚在一起,属于次生生长相关的NAC转录因子类别。Cl NAC1在雄球花中的表达量最大,在当年生成熟叶中最小;该基因在当年生半木质化茎中的表达量是未木质化茎的2.8倍,且在去年生茎木质部中的表达量比皮层大3倍左右。利用来自6个地理种源的40个无性系发现Cl NAC1内存在104个常见SNP位点,平均发生频率为1/24 bp,多样性水平达到0.012 53。编码区域有32个SNP位点,其中25个属于同义突变,7个属于错义突变。SNP多样性指数πtot、πsil、πs、πn在6个群体间的差异不显著,且不同群体的非同义突变多样性πn皆小于同义突变多样性πs。LD分析显示,当r2>0.1时,在6个群体中LD衰退序列长度在1 025~2 460 bp间变化,在基因内部LD水平已衰退至不显著。【结论】杉木Cl NAC1基因可能参与次生壁的发育。Cl NAC1在不同无性系间存在丰富的SNP变异,且在进化中主要受纯化选择作用。不同杉木群体中Cl NAC1基因SNP位点间的LD皆在较短序列长度内迅速消失,表明基于候选基因的LD作图策略在杉木关联作图研究中是可行的。

光皮桦BlCCoAOMT基因的克隆、表达及单核苷酸变异分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是植物木质素合成过程中的一个关键酶,对木质素组成和结构有重要的作用。为探究BlCCoAOMT基因在木质素合成中的作用,本研究从光皮桦中克隆了该基因,并分析其基因结构和表达模式,以及在73个基因型中的单核苷酸多态性(SNP)。结果表明,BlCCoAOMT基因cDNA全长1 114 bp,含有一个744 bp的完整ORF,编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白;该编码蛋白包含高等植物CCoAOMT所有的8个典型保守基序。BlCCoAOMT在木质化茎段中优势表达,且随着木质化程度提高而逐渐增强,表明BlCCoAOMT可能参与光皮桦木质素的生物合成;在拉弯处理的6 h到7 d间,该基因在应拉区发育木质部中的表达显著下调,与应拉木木质素含量的下降相符。共检测到BlCCoAOMT基因有119个SNP位点,平均每14 bp就有1个SNP位点,其中在外显子区域存在26个SNP位点,表明不同基因型中存在丰富SNP变异;在不同群体间BlCCoAOMT基因的分化程度无显著差异,且非同义突变和同义突变的位点的比值均小于1,表明在演化进程中主要受到了纯化选择压力。本研究结果为深入解析光皮桦木质素合成分子机制及后续分子标记辅助育种提供了理论依据。

杉木根边缘细胞生物学特性及其对铝胁迫的响应

【目的】分析杉木根边缘细胞的生物学特性及其对铝胁迫的响应,为进一步研究杉木对铝胁迫的响应机制和耐铝种质筛选提供参考。【方法】利用悬空气培法研究不同根长杉木幼苗根边缘细胞的数量、活性等生物学特性,并通过铝离子处理分析杉木根边缘细胞对铝胁迫的响应。【结果】杉木种子刚萌发时,根尖处就开始产生边缘细胞,且边缘细胞数量随着根的伸长而逐渐增多,在根长1.5 cm时达到最大值,平均7497个。边缘细胞活性在根长小于0.5 cm时可达95%,随着根的伸长会逐渐降低,但基本稳定在80%左右。在根边缘细胞发育过程中,根冠果胶甲酯酶(PME)活性随着根的伸长呈现出先高后低的趋势,进一步的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理表明PME活性与边缘细胞游离至根际环境有关。铝胁迫处理结果表明,铝离子会显著抑制杉木幼苗根的伸长,且这种抑制作用在擦除根边缘细胞后会更加明显;低浓度的铝离子(100-200μmol•L^(-1))会促使边缘细胞分泌更多黏液,黏液层阻止铝离子吸附在根尖部位,从而对根尖起到一定保护作用。【结论】杉木幼苗根尖会产生大量具有活性的边缘细胞,其游离至根际环境的过程可能主要受到PME酶的调控;这些根边缘细胞会对铝离子胁迫作出响应,分泌更多黏液,从而起到减轻铝毒害或保护根尖免受铝毒害的作用。

杉木应压木形成中的显微特征及主要代谢成分变化

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进行鉴定和解析。解剖发现应压木木质部管胞发生变形;化学成分测定发现总木质素和半纤维素含量增加,纤维素含量降低;GC-MS检测出应压木、对应木和直立木中共有成分20种,其中有机酸7种、单糖3种、二糖2种、醇类3种、氨基酸2种、酚类和糖苷类各1种;主成分分析结合显著性检验发现,3个时期应压木和直立木中有11种共有差异代谢物,其中乙醇酸、甘氨酸、核糖酸和棕榈酸在应压木中的含量显著低于对应木和直立木,苹果酸、松醇、肌醇、半乳糖和蔗糖在应压木中的含量显著高于对应木和直立木。本试验结果从代谢角度解释了杉木应压木形成中的生物学变化,可为揭示木材形成的分子机制提供新途径,并为高品质木材的定向培育和木材功能性改良提供理论依据。

光皮桦BlBLH1基因的克隆、表达及互作蛋白筛选

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2128 bp,开放阅读框(ORF)为1830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表明,BlBLH1与BlKNOX4、BlKNOX9在拟南芥原生质体内存在互作关系。而且,三者在茎段和应拉木的表达趋势基本一致。【结论】可从光皮桦中分离获得BlBLH1基因,生物信息学、表达和蛋白互作分析的结果表明BlBLH1参与光皮桦木材形成过程,且存在与KNOX蛋白的互作关系。

杉木Cl4CL基因的克隆及表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)催化肉桂酸、对-香豆酸等生成相应的辅酶A脂,是调控木质素单体合成的关键酶。本研究在杉木中克隆了4CL基因,长度为1 596 bp,包含完整开放阅读框,编码531个氨基酸,命名为Cl4CL基因。Cl4CL酶包含20种氨基酸,其中酸性氨基酸含量微高,并含有信号肽,属于分泌蛋白。Cl4CL包含两种高度保守的肽基序,分别为肽基序BoxⅠ(SGTTSRPKGV)和肽基序BoxⅡ(GEVCIRG),其中肽基序BoxⅠ属于AMP结合功能域,肽基序BoxⅡ含有催化反应基团。通过对Cl4CL基因的表达分析发现低氮胁迫下Cl4CL呈现下调表达。

Cloning and Bioimformatic Analysis of Cellulose Synthase-like Protein Gene,CICsID1 from Cunninghamia lanceolata

The protein structure of the cellulose synthase-like protein(CSL) was similar to cellulose synthase(CesA),including the conservative sequence D,D,D,QXXRW.One full-length cDNA of the cellulose synthase-like protein D(CslD) gene was cloned by reverse transcriptase(RT)-polymerase chain reaction(PCR) with 5’,3’ rapid amplification of cDNA ends(RACE) methods using degenerate primers designed from the homologous sequences of the CesA genes.A multiple comparison sequence analysis was conducted concurrently with bioinformatic methods to analyze the obtained sequence.Results of the sequence analysis showed that this cDNA was 4 150 bp in length and contained a single open reading frame encoding a protein of 1 132 amino acids.The multiple comparison sequence analysis showed that the deduced amino acid sequence shared high similarity (over 71%) with the ClCslD genes from Populus tremuloides,Oryza sativa,and Arabidopsis thaliana. This work will help lay an important foundation for further molecular studies with cellulose synthesis of plants.