嵌套引物P1/P7-U3/U5检测葡萄黄化(stolbur)植原体时扩增出的额外片段分析

当采用嵌套引物P1 /P7(U5 /P7) U3 /U5的巢式PCR检测植原体时,伴随着正常的0. 85kb片段还经常扩增出一条额外片段。与其它常见的非特异性片段不同,该额外片段十分稳定,与正常片段总是同步出现,二者的强度呈正比。经测定,额外片段的大小为0. 36kb。迄今,这一现象仅在采用P1 /P7(U5 /P7)- U3 /U5引物的巢式PCR中出现。在采用P1 /P7、U5 /P7或-U3 /U5引物的常规PCR中从未出现过。另外,已知这一现象至少在葡萄黄化stolbur和榆黄化植原体的检测过程中出现。对该现象产生的原因进行了深入研究,方法是将额外片段从凝胶中分离出来,用不同的引物在不同的条件下进行重新扩增,同时结合已知的植原体16SrRNA基因序列进行综合分析判断。结果表明,该额外片段源于植原体16SrRNA基因上存在的一个与U5引物部分互补的位点。对额外片段的测序结果进一步证实了分析的正确性。据此,指出了该额外片段在植原体检测中的可能用途。