基于HK-2细胞的左金丸中生物碱类组分体外毒性筛选及机制初探

目的基于肾小管上皮细胞HK-2筛选左金丸中主要生物碱类组分对肾细胞损伤。方法采用CCK-8法和高内涵筛选技术筛选左金丸主要生物碱中潜在肾细胞损伤成分。通过细胞形态、乳酸脱氢酶和细胞色素C释放率及凋亡相关蛋白表达等进行确证,初步确定造成细胞损伤作用的生物碱,为组分中药配伍组方和配伍减毒提供体外毒理学依据。结果采用CCK-8法和高内涵技术初步筛选,表明吴茱萸碱(EVO)能够显著降低细胞数目,升高细胞膜通透性,降低线粒体膜电位。此外,细胞形态、细胞凋亡和细胞色素C表达与高内涵筛选结果一致,Western blot实验表明EVO能够诱导细胞凋亡造成肾细胞损伤。结论 EVO可明显导致肾细胞损伤,可能是通过影响线粒体、细胞色素C及细胞膜通透性诱导细胞凋亡。

3种肝源永生化细胞药物代谢酶表达差异比较研究（英文）

目的比较3种人源肝永生化细胞LX-2,L02和HepG2药物代谢酶的表达差异,确定适合于特定细胞色素P450(CYP)亚型研究的细胞类型。方法体外培养人源传代肝细胞L02,LX-2和HepG2,以奥美拉唑(Ome)、地塞米松(Dex)、苯巴比妥钠(Phe)、异烟肼(Iso)和利福平(Rif)0,5,10,20和40 μmol·L^-1进行诱导。CCK-8法检测细胞存活,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测LX-2细胞中CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1 和 CYP3A4 基因表达水平;Western印迹法检测LX-2,L02 和HepG2细胞中以上7种CYP亚型蛋白表达水平;LX-2,L02和HepG2经Rif 5,10,20和40 μmol·L^-1诱导后,Luciferin-PFBE法检测细胞中CYP3A4酶活性变化。结果 CCK-8结果显示,与相应细胞对照组相比,Ome,Dex,Phe,Iso和Rif (≤ 40 μmol·L^-1)作用于LX-2,L02和HepG2细胞24 h,细胞存活率均>80%;RT-qPCR法检测结果显示,与LX-2细胞对照组相比,Phe诱导CYP2B6(P<0.05)和CYP2D6(P<0.01)表达上升;Western蛋白印迹结果显示,L02,LX-2和HepG2细胞经Ome,Dex,Phe,Iso和Rif 40 μmol·L^-1处理后,CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4蛋白表达存在差异。L02细胞中 CYP2C9(IA=1.58±0.07),CYP2C19(IA=0.96±0.02)和 CYP3A4(IA=1.30±0.01),LX-2 细胞中CYP2B6(IA=1.48±0.01)和 CYP2D6(IA=1.46±0.02),HepG2 细胞中的CYP1A2(IA=1.62±0.19)和CYP2E1(IA=1.49±0.10)分别具有最高的表达丰度。CYP3A4 酶活性检测显示,Rif 处理 L02,LX-2 和HepG2细胞24 h后,CYP3A4活性变化无统计学差异。结论 L02,LX-2和HepG2细胞中CYP亚型蛋白表达丰度差异提示,L02 细胞适用于 CYP2C9,CYP2C19 和 CYP3A4 实验;LX-2 细胞适用于 CYP2B6 和CYP2D6实验;HepG2细胞适用于CYP1A2和CYP2E1实验。

基于药物相互作用研究麦冬皂苷D对麦冬皂苷D′急性和亚急性毒性的影响

目的基于药物相互作用研究麦冬皂苷D(OPD)对麦冬皂苷D′(OPD′)急性和亚急性毒性的影响。方法①采用Bliss法测定急性毒性:小鼠分为OPD′单用、OPD+OPD′(OPD和OPD′提前混合)和OPD→OPD′(先注射OPD间隔15 min再注射OPD′)组,其中OPD′单用组5个剂量分别为3.127,6.460,9.979,10.245和13.098 mg·kg^(-1);OPD+OPD′组OPD和OPD′1∶1混合,5个剂量分别为5.711,6.129,7.626,8.712和10.262 mg·kg^(-1);OPD→OPD′组OPD固定为1.0 mg·kg^(-1),OPD′5个剂量分别为11.351,15.551,22.732,26.568和30.137 mg·kg^(-1)。单次尾静脉注射,观察给药后14 d内小鼠的行为表征和死亡数。②亚急性毒性试验:SD大鼠随机分为5组,分别为正常对照、OPD单用(0.25 mg·kg^(-1))、OPD′单用(0.25 mg·kg^(-1))、OPD+OPD′(各0.25 mg·kg^(-1))和OPD→OPD′(各0.25 mg·kg^(-1))组,连续尾静脉注射,每天1次,连续30 d,观察心、肝、脾、肺和肾组织病理变化及血常规、血生化和脏器指数等指标的变化。结果①急性毒性试验结果表明,OPD′单用组OPD′的LD50值为7.785 mg·kg^(-1),OPD+OPD′组为7.706 mg·kg^(-1),OPD→OPD′组为22.820 mg·kg^(-1);OPD→OPD′组明显高于OPD′单用组。②亚急性毒性试验结果表明,与正常对照组比较,其他各给药组大鼠体重显著下降(P<0.05,P<0.01),脾指数显著增大(P<0.05,P<0.01);除OPD单用组外,其他给药组肺指数均显著增大(P<0.05,P<0.01),血清葡萄糖和甘油三酯水平显著下降(P<0.05,P<0.01),其余生化指标无显著性差异;各给药组心肌细胞轻度水肿,心肌间质血管淤血,脾红髓淤血,肺泡上皮细胞轻度肿胀,肺泡壁血管不同程度淤血。上述指标OPD+OPD′和OPD→OPD′组与OPD′或OPD单用组比较均无明显变化。结论在急性毒性试验中,OPD先于OPD′使用可有效降低OPD′毒性;在亚急性毒性试验中未观察到此作用。

麦冬皂苷D干预内质网应激减轻麦冬皂苷D'所致心肌细胞损伤

研究麦冬皂苷D对麦冬皂苷D'诱导大鼠心肌细胞凋亡的干预作用及可能机制,为麦冬皂苷类成分的毒效差异深入研究提供参考。CCK-8法检测麦冬皂苷D与麦冬皂苷D'共处理对细胞存活率的影响; Western blot法及RT-PCR法检测麦冬皂苷D及麦冬皂苷D'对内质网应激相关基因PERK,Bip,ATF-4,p-eIF2α及CHOP表达的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡率;通过内质网形态特异性示踪探针检测麦冬皂苷D'造成的内质网形态改变及麦冬皂苷D的逆转效果,探究麦冬皂苷D保护心肌细胞损伤的可能作用机制。细胞实验结果显示,6μmol·L-1的麦冬皂苷D'可显著诱导内质网应激相关蛋白的表达,导致细胞内质网形态发生变化,促进细胞凋亡。不同浓度的麦冬皂苷D可在一定程度上逆转麦冬皂苷D'引起的心肌细胞损伤。结果表明,麦冬皂苷D可降低麦冬皂苷D'触发的内质网应激,进而对心肌细胞产生保护作用。

何首乌6种成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用

该文探讨何首乌中6种化学成分(没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素)对人孕烷X受体(humanpregnant X receptor,PXR)介导的CYP3A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3A4转录调控区的报告基因载体共转染HepG2细胞,10μmol·L-1利福平为阳性对照,10μmol·L-1酮康唑为阴性对照,用何首乌中6种成分--没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素(5,10,20μmol·L-1)分别处理24 h,进行双荧光素酶活性检测。结果表明,空载质粒pc DNA3. 1与p GL4. 17-CYP3A4共转染时没食子酸、白藜芦醇对CYP3A4的调控为抑制效应,槲皮素、山柰酚、木犀草素对CYP3A4产生诱导作用;pc DNA3. 14-PXR与p GL4. 17-CYP3A4共转染时,槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素均产生诱导效应。综上所述,6种成分对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,5种成分对CYP3A4产生诱导效应,其中3种成分的诱导效应具有显著性差异。该研究提示,在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高安全性和有效性。

黄连碱通过线粒体损伤及内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路导致L02细胞毒性

目的研究黄连碱(coptisine)对正常人肝细胞L02的细胞毒性及作用机制,为临床安全用药提供参考。方法分别以不同浓度黄连碱作用于L02细胞24 h,通过CCK-8法检测黄连碱对L02细胞存活率的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位和细胞内活性氧(ROS)含量的改变,激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位和细胞内钙离子水平的变化,Western印迹检测L02细胞内Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3(caspase-3)、细胞色素C(cytochrome C)、免疫球蛋白结合蛋白(BIP)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、CCAAT增强子结合蛋白(CHOP)、激活转录因子4(ATF4)、真核生物启动因子2α(eIF2α)、caspase-12蛋白表达水平,探讨黄连碱细胞毒性的可能作用机制。结果黄连碱能以浓度依赖方式抑制细胞存活,诱导L02细胞凋亡,可促使细胞内ROS大量蓄积,线粒体膜电位下降,细胞色素C、Bax蛋白表达量上升;同时,还可激活内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路,显著影响相关蛋白的表达,其中BIP、CHOP、ATF4蛋白表达量升高,PERK、eIF2α蛋白表达量下降,明显诱导细胞内钙离子含量升高,激活下游因子caspase-12、caspase-3蛋白表达。结论黄连碱可通过线粒体途径和内质网应激(ERS)途径诱导L02肝细胞凋亡,其潜在的肝毒性风险及对中药黄连安全性的影响有待进一步研究。

雄黄及三氧化二砷对小鼠肠道菌群的初步探究

观察雄黄及三氧化二砷对肠道菌群的影响。实验分为雄黄低剂量组(RL)、雄黄中剂量组(RM)、雄黄高剂量组(RH)、三氧化二砷组(ATO),其中ATO组与RL组中三价砷含量一致。灌胃1周建立雄黄及三氧化二砷毒性模型,第8天给药1 h后收集小鼠粪便,通过对细菌16S rRNA基因检测观察雄黄对小鼠肠道菌群的影响。结果发现,各给药组乳酸菌属均减少,瘤胃球菌属、粘放线菌属等增多。RL组与ATO组在普氏菌属、瘤胃球菌属、粘放线菌属等具有一致性,但在乳酸菌属、拟杆菌属等具有差异性。由此得出,雄黄与三价砷等量的三氧化二砷对肠道菌群影响具有相似性,但仍有差别;雄黄给药后肠道保护性细菌如乳酸菌属等减少,发生炎症;低剂量时抗炎性细菌如瘤胃球菌属、粘放线菌属等增多,可以抵消菌群失调造成的轻度炎症;高剂量时菌群紊乱,变形菌门增多,肠道炎症加剧,出现水肿等炎症反应。因此,作者认为临床使用雄黄后胃肠道不良反应可能与菌群紊乱有关,雄黄临床使用时应小剂量配伍使用,以减轻肠道炎症的发生。

Tetramethylpyrazine protects lymphocytes from radiationinduced apoptosis through nuclear factor-κB

AIM: Radiation induces an important apoptosis response in irradiated organs. The objective of this study was to investigate the radioprotective effect of tetramethylpyrazine(TMP) on irradiated lymphocytes and discover the possible mechanism of protection. METHOD: Lymphocytes were pretreated for 12 h with TMP(25-200 μmol·L-1) and then exposed to 4 Gy radiation. Cell apoptosis and the signaling pathway were analyzed. RESULTS: Irradiation increased cell death, DNA fragmentation, activated caspase activation and cytochrome c translocation, downregulated B-cell lymphoma 2(Bcl-2) and up-regulated Bcl-2-associated X protein(Bax). Pretreated with TMP significantly reversed this tendency. Several anti-apoptotic characteristics of TMP, including the ability to increase cell viability, inhibit caspase-9 activation, and upregulate Bcl-2 and down-regulate Bax in 4Gy-irradiated lymphocytes were determined. Signal pathway analysis showed TMP could translate nuclear factor-κB(NF-κB) from cytosol into the nucleus. CONCLUSION: The results suggest that TMP had a radioprotective effect through the NF-κB pathway to inhibit apoptosis, and it may be an effective candidate for treating radiation diseases associated with cell apoptosis.