重组酶聚合酶扩增在铜绿假单胞菌检测中的应用

目的 建立一种优化的重组酶聚合酶扩增（RPA）方法，用于临床快速检测铜绿假单胞菌。方法 （1）提取1株铜绿假单胞菌标准菌株DNA模板，采用PCR、实时荧光定量PCR和RPA进行检测，统计3种方法检测的加样时长、扩增时长和检测时长。（2）取1株铜绿假单胞菌标准菌株，复苏摇菌后逐次稀释为1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4、1×10^3、1×10^2、1×10^1集落形成单位（CFU）/mL 7个浓度梯度，以恶臭假单胞菌为阴性对照，分别提取DNA模板，进行RPA、实时荧光定量PCR及PCR，分析3种方法检测铜绿假单胞菌的灵敏性。（3）取1株铜绿假单胞菌标准菌株和4株阴性对照菌（金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、白色念珠菌和恶臭假单胞菌），分别提取DNA模板，行RPA、实时荧光定量PCR及PCR，分析3种方法检测铜绿假单胞菌的特异性。（4）取28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株、1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株，以恶臭假单胞菌为阴性对照，分别提取DNA模板，行RPA。观察上述菌株是否出现阳性扩增信号，并计算其检出率。所有实验重复3次。采用GraphPad Prism 5.01统计软件对灵敏性结果进行分析。结果 （1）RPA、PCR和实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌的加样时间均为20 min，其中PCR扩增98 min，凝胶检测20 min，共计138 min；实时荧光定量PCR扩增和检测可同步完成，需90 min，共计110 min；RPA中扩增和检测也可同步完成，需15 min，共计35 min。（2）3种检测方法中恶臭假单胞菌均未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果。实时荧光定量PCR和PCR中铜绿假单胞菌检测下限为1×10^1 CFU/mL，RPA中铜绿假单胞菌检测下限为1×10^2 CFU/mL。RPA、实时荧光定量PCR中，铜绿假单胞菌浓度越高，出现阈值时间越短、循环数越少，即检测到阳性扩增信号的时间越短。实时荧光定量PCR中，铜绿假单胞菌浓度为1×10^1-1×10^7 CFU/mL时，均能检测到阳性扩增信号。RPA中，铜绿假单胞菌浓度为1×10^1 CFU/mL时，其阳性扩增信号检出率为0；浓度为1×10^2 CFU/mL时，其阳性扩增信号检出率为67%；浓度为1×10^3-1×10^7 CFU/mL时，其阳性扩增信号检出率为100%。（3）RPA、PCR和实时荧光定量PCR中，铜绿假单胞菌出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果，鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及恶臭假单胞菌4种阴性对照菌未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果。（4）RPA中，28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株及1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株均出现阳性扩增信号，恶臭假单胞菌未出现阳性扩增信号；29株临床铜绿假单胞菌阳性扩增信号检出率为100%。结论 本研究建立的优化的铜绿假单胞菌RPA快速检测方法，耗时短，灵敏性及特异性强，对临床快速检测铜绿假单胞菌感染具有重要应用价值。