浓缩苹果汁中扩展青霉菌实时PCR快速检测条件的优化

为了研究苹果汁生产中棒曲霉素产生菌的快速检测,利用实时PCR方法快速检测扩展青霉的可能性,对扩增条件进行优化。在polygatacturonase基因引物设计和传统PCR扩增扩展青霉DNA的基础上,研究实时PCR扩增时退火温度、引物浓度以及底物质量浓度对扩增效果的影响,以获得最佳的参数。结果表明,用Lightercy-cler实时PCR扩增扩展青霉DNA的最佳退火温度为61℃,最佳引物浓度为0.20-0.40μmol/L,底物质量浓度对实时PCR扩增的影响较小。在以上参数下,可以获得良好的PCR扩增曲线、产物溶解曲线以及清晰的产物条带。研究获得的快速检测扩展青霉的实时PCR参数,可用于浓缩苹果汁工业化生产中扩展青霉的快速检测,也可作为其他微生物实时PCR检测时的方法学参考。

PCR法快速检测扩张青霉

【目的】研究棒曲霉素扩张青霉菌(Penicillium expansum)的快速和特异性PCR检测方法。【方法】通过P.expansum的纯菌平板和液体培养以及纯菌接种于苹果、苹果果肉和苹果汁,用Cenis改良方法提取DNA,以基于isoepoxydon dehydrogenase和polygatacturonase编码基因的两对引物扩增P.expansum DNA,建立特异和快速的检测P.expansum的方法。【结果】基于polygatacturonase基因的引物具有很强的特异性,只有目标DNA片段被扩增,而基于isoepoxydon dehydrogenase基因的引物扩增特异性较差。纯培养可以检测到5×10-6μgDNA/每反应体系,整个检测时间约为5h,比传统培养法(4～6d)时间大大缩短。苹果、苹果果肉和果汁接种纯P.expansum后所提DNA都得到了很好的扩增,具有很高的特异性,不受苹果样品DNA的干扰。【结论】本研究建立的P.expansum的PCR检测方法特异、快速、灵敏,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中P.expansum的快速检测和质量控制,也可用于工艺过程对P.expansum污染的快速溯源。