喹诺酮类抗生素对氢氧化细菌脱氮性能的影响途径与机理研究

针对一株氢氧化细菌Ideonellasp.TH17进行污水生物脱氨氮研究,并应用分子生物学技术解析两种典型喹诺酮类抗生素及其混合物对TH17氨同化的影响途径和机理。结果表明,低浓度(5µg/L)喹诺酮类抗生素对TH17脱氮性能具有促进作用,浓度升高则出现抑制作用,混合抗生素削弱了高浓度抗生素对TH17脱氮性能的抑制作用。在5µg/L喹诺酮类抗生素胁迫下,TH17氨同化基因表达上调,氨同化酶和抗氧化系统酶活性提升。同时,TH17抗性基因表达上调,增加了细胞的抗生素耐受性。进一步地,TH17胞内氨基酸、嘌呤和生物素代谢等通路显著上调,为氮代谢提供能量、底物和辅酶,最终提升了氨同化性能。研究结果从基因、酶和代谢物分子水平上揭示了低浓度喹诺酮类抗生素对TH17脱氮性能的影响途径与机理,可为污水生物脱氮新技术的开发和应用提供理论支撑。

重组大肠杆菌利用醋酸及乳酸为碳源合成PHB

以廉价的工业副产物醋酸及乳酸为碳源,对产PHB重组大肠杆菌进行培养,考察醋酸及乳酸的添加对重组大肠杆菌生长及PHB产量的影响。将来自Cupriavidus necator的PHB合成操纵子phaCAB基因簇克隆至pBAD载体,得到产PHB菌株BL21_pBAD_phaCAB,以阿拉伯糖为诱导剂,在大肠杆菌中进行重组表达。分别使用LB及M9培养基,对重组菌株BL21_pBAD_phaCAB进行培养,研究其生长速度及PHB产量,探索产PHB重组大肠杆菌最适培养基。以添加0.04 g/L乳酸、1.2 g/L乳酸、0.02 g/L醋酸、0.6 g/L醋酸、0.04 g/L乳酸+0.02 g/L醋酸、1.2 g/L乳酸+0.4 g/L醋酸的M9培养基(均含2 g/L葡萄糖)为实验组,以M9培养基(含2 g/L葡萄糖)为对照组,考察醋酸及乳酸的添加对重组大肠杆菌生长及PHB产量的影响。分别取第6,12,24和36小时的培养液,分析其葡萄糖、醋酸及乳酸含量的变化。结果表明,低氮型M9培养基更适合产PHB重组大肠杆菌在低糖培养环境中生长。在葡萄糖消耗殆尽后,大肠杆菌能够以醋酸及乳酸为碳源进行代谢,因此在培养基中添加一定浓度的醋酸及乳酸能够有效地提高重组菌株BL21_pBAD_phaCAB产PHB能力,在乳酸添加量为1.2 g/L时,PHB产量达到最高(1.43 g/L),比对照组提高78%。

不同光质对嗜热蓝细菌Synechococcus sp.PCC6715生长的影响

使用光合有效光量子数密度(PAR)均为100μmol/(m^2·s)的白光(对照)、红光和蓝光,对对数生长期的嗜热蓝细菌PCC6715进行培养,以期探明不同光质对不表达藻红素的蓝细菌光适应生长的影响。结果表明,在不同光质培养对数生长期PCC6715的过程中,与白光相比,干重在蓝光下明显增加,红光下明显减少;红、蓝光质对光合色素合成产生影响的开始时间和持续时间有所不同;最大光能转化效率(Fv/Fm)在蓝光下明显提高,红光下明显降低,培养6天后,红、蓝光条件下的Fv/Fm均趋于稳定。蓝光有利于PCC6715的生长,红光不利于PCC6715的生长;同时,PCC6715在红、蓝光质中均产生适应性生长,藻蓝素的减少使PCC6715在红光中发生适应性生长,蓝光中PCC6715发生适应性生长是由于藻蓝素的增加。

深圳湾水域微藻的分离及分子生物学鉴定

微藻应用广泛,微藻生物燃料是近年研究热点。深圳的地理和气候条件都非常适宜微藻的生长,具有丰富的微藻资源。从深圳湾水域3个不同位置分别采集了表层和深层(5 m)的水样,利用Soil extrat培养基和Kuhl培养基对水样中的微藻进行分离。将分离得到的菌株扩大培养后提取其基因组DNA,经聚合酶链式反应(PCR)放大18S rRNA,利用内切酶pstⅠ和TaqⅠ对PCR产物进行双酶切反应以筛选不同的菌株。将不同菌株的PCR产物测序后通过与美国国家生物技术信息中心数据库比对,确定微藻品种。共得到微藻菌株71个,分属于16个不同的属,利用MEGA 5软件建立了系统发育树。同时,初步建立了深圳本地微藻种质资源库。

不同碳源条件对集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942生长的影响研究

文章考察了单独添加NaHCO_3作为碳源以及同时提供CO_2混合气曝气和NaHCO_3作为碳源对集胞藻PCC6803及聚球藻PCC7942生长情况的影响。研究结果表明:单独添加NaHCO_3作为碳源的情况下,在NaHCO_3的初始浓度为0.1 mol/L的培养液中,两株微藻的生长速率最高;当NaHCO_3的初始浓度为0.2,0.3mol/L时,PCC6803的生长速率明显低于PCC7942,并在培养后期出现OD_(685 nm)值下降的情况。同时提供CO_2混合气曝气和NaHCO_3作为碳源的情况下,两株微藻的生长速率最高值对应的情况存在较大差异,PCC6803和PCC7942分别能够在CO_2曝气条件下和空气曝气条件下在NaHCO_3的初始浓度为0.1 mol/L的培养液中呈现出最高的生长速率。

不同培养条件对嗜热蓝细菌生长及活性物质的影响研究

为了探究嗜热蓝细菌的生长特性,文章设置了不同的温度和NaHCO3浓度,研究不同条件对分离所得的两株嗜热蓝细菌Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCT E111和Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCT E732的生长以及活性物质积累的影响,从而预估其固定烟道气中的CO2的潜力。研究结果表明:在一定温度范围内,嗜热蓝细菌的生长速率随着温度的升高而加快;二者均可在高温环境下生长,最佳生长温度均为50℃,其中,Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCT E732可在温度为60℃的条件下缓慢生长;适宜的NaHCO3浓度会促进两株蓝细菌的生长,当NaHCO3的浓度为0.1 mol/L时,两株蓝细菌的生长情况最佳,当NaHCO3的浓度为0.3,0.5 mol/L时,两株蓝细菌能够正常生长,当NaHCO3的浓度达到1 mol/L时,两株蓝细菌均无法存活;提升温度和NaHCO3浓度,能够促进蓝细菌内活性物质的积累,从而增加藻胆蛋白的合成量,改变脂肪酸的组成。

基于双氨基粘土絮凝的嗜热微藻采收实验研究

文章将双氨基粘土([MgAC]和[CeAC]的混合物)作为絮凝剂,并研究了[MgAC]和[CeAC]的配用比例和絮凝时间对采收效果的影响。研究结果表明:当[MgAC]与[CeAC]的配比分别为8∶1,5∶1,2∶1和1∶2时,微藻的絮凝效率均可在20 min内达到75%以上;与单独使用[MgAC]或[CeAC]相比,双氨基粘土形成的紧凑网络可在微藻细胞之间进行有效桥接,从而提高微藻采收效率,综合考虑经济性及絮凝效果,确定[MgAC]与[CeAC]的最优配比为8∶1;微藻采收效率与藻液细胞密度有较大关系,过高的藻液细胞密度会使微藻采收效率大大降低;使用双氨基粘土絮凝微藻不会影响微藻培养液的pH值,且双氨基粘土絮凝剂不会影响微藻细胞的生理活性,以及后续的开发应用。

一株分离自四川温泉的嗜热鞘丝藻新种鉴定

为了确定分离自四川甘孜地区温泉的嗜热丝状菌株B121的分类信息,为探索其应用价值提供遗传学分析基础,对其进行基因组分析、系统发育分析、二级结构预测、形态学鉴定以及结合菌株钠盐耐受性和固氮能力的整体分析。在16S rRNA的系统发育分析中,发现菌株B121与菌株Thermoleptolyngbya oregonensis PCC 8501,Thermoleptolyngbya albertanoae ETS-08和Thermoleptolyngbya sp.O-77等嗜热鞘丝藻属菌株有较好的聚类。在16S-23S ITS二级结构预测分析中,菌株B121的D1-D1'区域与属内参考菌株有一定的相似性,序列同一性也较高,但都没有到达广义的同种物种标准,并且V2,BoxB及V3区域与其他对照菌株的差异较大。结合形态学分析,确定菌株B121是Thermoleptolyngbya属下的一个新种。菌株B121可在最高浓度为0.5 M的NaCl和NaNO_(3)培养基中生存,也可在浓度为1 M的NaCl培养基中存活。当气相条件为Ar:N_(2):CO_(2)=79:20:1(体积比)时,菌株B121的乙炔还原速率可以达到2564.1 nmol/(g·h)。

嗜热蓝细菌PKUAC-E542藻蓝蛋白耐热性以及不同光照条件对其含量影响研究

对PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性进行测试,探究其热稳定性能。同时,在不同光周期和不同光质光源组合条件下培养嗜热蓝细菌PKUAC-SCTE542,研究其生长情况和藻蓝蛋白含量,探索适用于藻蓝蛋白生产的光照条件。选取30℃,40℃,50℃,60℃,65℃,70℃,80℃,90℃为实验组,25℃和4℃为对照组,放置时间设为5小时和14天,用紫外分光光度计测定藻蓝蛋白全光谱图,考察不同温度和放置时间对藻蓝蛋白的影响,再将E542-PC的α链和β链与蛋白质晶体结构数据库中藻蓝蛋白进行比对,深入了解其耐热机制。分别在光波长为白光(400~800 nm)、红光(654 nm)、绿光(511 nm)和蓝光(454 nm),光周期为8L/16D,12L/12D和16L/8D的条件下培养蓝细菌,测定其生物质干重以及藻蓝蛋白含量。结果表明,PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白在65℃环境可以保持稳定,60℃放置14天仍表现出60%的热稳定性。光质为红光、光周期为16L/8D的条件下,藻蓝蛋白绝对产量最大;光质为红光、光周期为8L/16D时,藻蓝蛋白产率最高。实验结果表明PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性能较好,经过光照条件筛选,藻蓝蛋白产量可提高近100 mg/gDCW。

深圳海域6株破囊壶菌的生长特性及油脂成分分析

【目的】从深圳海域分离得到6株破囊壶菌,对其基本形态特征、生活史和油脂含量等进行研究,开发其应用潜力。【方法】使用松花粉垂钓法对破囊壶菌进行分离,通过18S r RNA基因测序的方法对破囊壶菌进行鉴定,用显微镜观察其基本形态特征,通过使用尼罗红(Nile Red)染色法对油脂含量进行定性检测,并用GC-MS分析菌株的油脂含量和组成情况。【结果】18S r RNA基因鉴定其属于Aurantiochytrium sp.、Schizochytrium sp.和Thraustochytrium sp.三个属。破囊壶菌的脂肪酸主要成分为十六碳饱和脂肪酸和二十二碳六烯酸(DHA),其中Mn11和Mn15的饱和脂肪酸含量达到总脂肪酸含量的70%以上,Mn16和Sw7的DHA产量分别达到1.29 g/L和1.26 g/L。【结论】Mn11和Mn15菌株适合用于生物柴油的生产,Mn16和Sw7是DHA发酵生产的潜力菌株。

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。

两株采自惠州的细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae)嗜热蓝细菌的分离鉴定及细胞组分分析

【背景】随着CO_2排放增加,全球变暖愈发严峻,嗜热蓝细菌作为能够在45°C及以上环境中生长并实现生物固碳的微生物,具有重要的研究意义。【目的】对从广东惠州地区采集的藻种进行分离鉴定,并筛选出2株嗜热蓝细菌,研究其生长特性,为嗜热蓝细菌的后续应用提供依据。【方法】通过16SrRNA基因、藻蓝蛋白链A基因(PhycoA)序列分析确定从惠州地区采集到的菌株的分类学位置。对PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29两株嗜热蓝细菌进行形态观察和主要细胞成分(灰分、糖类、脂质、蛋白质和色素)分析。【结果】共分离出12株嗜热蓝细菌,其中PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29菌株,形态上呈蓝绿色球形毛状体,是由细胞形成密集的簇,彼此附着形成的。两株嗜热蓝细菌的主要细胞成分是糖类,分别占细胞干重的36.42%和28.46%。PKUAC-GDTS1-24的灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.41%、21.40%和26.64%。PKUAC-GDTS1-29的细胞中,灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.72%、23.92%和12.93%。藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)在PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29中的含量分别为157.29 mg/g DW和374.86 mg/g DW,类胡萝卜素分别为65.13 mg/g DW和18.87 mg/g DW。【结论】基于系统发育树研究,本实验的2个分离株属于细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae),与研究较少的纤发鞘丝蓝细菌属(Leptolyngbya)菌株相近,可能是广东和四川温泉中存在的一种新型丝状轻度嗜热蓝细菌属或Leptolyngbya新种。嗜热菌株PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29的形态和细胞组成相似,通过比较,2个菌株的藻胆蛋白含量远远高于其他研究报道的Leptolyngbya蓝细菌,尤其是PKUAC-GDTS1-29可以作为藻蓝蛋白生产的潜在菌株。

破囊壶菌脂肪酶基因的克隆、双温控自诱导表达及酶学性质研究

【目的】克隆破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】基于转录组数据注释,获得脂肪酶基因lip,构建重组基因工程菌Rosetta(DE3)/p ET30-lip,利用双温控自诱导方法高效表达蛋白,表达产物(LIP)经Ni-Agarose His亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从Aurantiochytrium sp.PKU#SW7中克隆得到一个大小为873 bp的脂肪酶基因(Gen Bank登录号为KT305964),该酶对p-NPB最适反应温度和pH分别为40°C和8.0。以不同浓度的金属离子Ca^(2+)和Co^(2+)溶液分别保温处理酶液30 min可使酶活提高1.3倍左右;甲醇对脂肪酶的抑制作用不明显。在最适反应条件下对p-NPP与p-NPB的酶活力分别为70.0±3.1 U/mg和102.5±2.6 U/mg。【结论】Aurantiochytrium sp.PKU#SW7脂肪酶具有良好的特性,符合生物柴油生物催化剂基本要求。

嗜热蓝细菌碳酸酐酶基因的异源表达及酶学性质

【背景】碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CAH)因其高效催化CO2转化为HCO3–的能力成为当今碳减排工艺中的研究热点,但因工厂烟道气的温度较高,因此寻求热稳定性高的嗜热碳酸酐酶是碳酸酐酶仿生学固碳的关键所在。【目的】克隆嗜热蓝细菌Thermosynechococcuselongatus PKUAC-SCTE542和SynechococcuslividusPCC6715的碳酸酐酶基因Ecah、Pcah,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】利用PCR技术获得碳酸酐酶基因cah,构建重组基因工程菌BL21_pETM11_CAH,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白,表达产物(CAH)经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后,进行酶学性质研究。【结果】从E542、PCC6715中克隆得到大小均为534 bp的碳酸酐酶基因,以CO2为底物,酶催化CO2水合的活性分别为42.6 WAU/mg-protein、47.6 WAU/mg-protein。碳酸酐酶ECAH 50°C处理30 min后,酶活提高了8%,而PCAH却下降了10%。Zn2+、磺胺对两种碳酸酐酶有显著抑制作用,Ca2+对ECAH有轻微激活作用,对PCAH无显著抑制作用。【结论】E542嗜热蓝细菌表达的碳酸酐酶比PCC6715的热稳定性强,符合处理工业高温点源烟道气的CO2的基本要求,丰富了碳减排的嗜热碳酸酐酶基因库。