X线诱导大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型的构建及评价

目的:建立一种由X线诱导的大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型并对其进行验证评价。方法:选取12只清洁级成熟SD大鼠,取其腰段椎间盘髓核做体外细胞培养,将培养好的髓核细胞按照接受X线照射剂量随机分为0Gy组(对照组)、5Gy组、10Gy组、15Gy组。随后通过细胞形态学观察、β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞增殖检测(cell counting kit-8,CCK-8)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测、免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测、蛋白印迹实验(Western blot,WB)、1,9-二甲基亚甲基蓝(1,9-dirnethyl-methylene blue,DMMB)比色法检测等实验方法,观察比较不同组别髓核细胞衰老程度和增殖情况,检测衰老相关基因、蛋白和相关因子的表达情况。结果:随着接受X线辐射剂量的增大,髓核细胞在形态学上逐渐表现出典型的衰老特征,并且衰老程度与射线剂量呈正相关,SA-β-Gal测定显示对照组、5Gy组、10Gy组、15Gy组髓核细胞阳性百分比分别是15%、41%、88%和77%。CCK-8实验显示随着辐射剂量的增加,髓核细胞增殖率逐渐降低,第5天10Gy组髓核细胞恢复增殖,而15Gy组髓核细胞仍无增殖表现,FCM证实其细胞仍存在活性,而当辐射剂量提升至20Gy,髓核细胞早期凋亡率骤增。IF及PCR检测均显示衰老基因p16、p21的表达随着髓核细胞接受辐射剂量的增加而逐渐增强,同时聚集蛋白聚糖碎片(aggrecan fragmentation)在WB实验中的表达也逐渐增强。以上实验结果提示15Gy为适宜辐射剂量,再次将15Gy组与对照组比较,CCK-8显示第9天15Gy组髓核细胞依然无增殖表现,PCR检测aggrecan fragmentation的表达15Gy组明显高于对照组(P<0.05)。基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3以及炎症因子IL-6、IL-8在PCR及IF中的表达,15Gy组也明显高于对照组(P<0.05)。结论:X线能诱导体外平面培养的大鼠髓核细胞衰老,接受15Gy辐射量的髓核细胞衰老程度明显且稳定,可作为理想的髓核细胞衰老模型。

电离辐射诱导椎间盘纤维环细胞衰老的研究

[目的]探讨电离辐射对大鼠纤维环细胞衰老及衰老相关分泌表型表达的影响。[方法]选取6只成熟SD大鼠,取其腰尾段椎间盘纤维环细胞做体外细胞培养,将同等条件下培养的纤维环细胞随机分为两组,分别接受剂量为0 Gy、15 Gy的X线电离辐射,检测两组纤维环细胞的衰老情况以及细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的表达。[结果]经15 Gy电离辐射处理后,纤维环细胞在形态学上表现出典型的衰老特征,SA-β-Gal测定显示纤维环细胞阳性染色百分比为77%。CCK-8实验显示纤维环细胞9 d内,未辐射组的OD值逐渐增加(P<0.05),而辐射组OD值比较的差异无统计学意义(P>0.05)。IF及PCR检测均显示,辐射组衰老相关基因,包括P16[(5.2±0.3)vs(1.0±0.1),P<0.001]、P21[(12.9±0.5)vs(1.0±0.1),P<0.001]的mRNA相对表达量均显著高于未辐射组。此外,辐射组SASP的表达,包括胶原蛋白Col-1[(1.6±0.1)vs(1.0±0.1),P=0.004]、Col-2[(7.0±0.4)vs(1.0±0.1),P<0.001]、白细胞介素(interleukin,IL)-6[(7.9±0.2)vs(1.0±0.1),P<0.001]、IL-8[(1.8±0.1)vs(1.0±0.1),P<0.001]、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1[(39.2±0.6)vs(1.0±0.1),P<0.001]、MMP-3[(4.5±0.3)vs(1.0±0.1),P<0.001]的相对表达量均显著高于未辐射组。[结论]电离辐射能诱导大鼠椎间盘纤维环细胞衰老,其衰老相关分泌表型的表达明显增加。