橡胶树F3’H基因克隆及其功能分析

从橡胶树叶片转录组数据库中调取花青素合成途径中的关键酶类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因序列信息,通过RT-PCR扩增得到2个橡胶树F3’H基因,分别命名为HbF3’H1和HbF3’H2。通过荧光定量PCR分析发现,只有HbF3’H1基因在不同发育时期的橡胶树叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的合成积累趋势完全一致。HbF3’H1所编码的蛋白属于P450超家族,具有保守的F3’H结构域,而且HbF3’H1基因的启动子中包含多种环境效应元件,说明HbF3’H1基因的表达受环境因子调控。通过农杆菌转化烟草发现,过表达HbF3’H1基因的烟草花瓣大量累积花青素,其颜色较非转基因烟草显著加深,同时,荧光定量PCR发现HbF3’H1表达水平与转基因烟草花瓣颜色呈正相关,说明HbF3’H1基因表达促进花青素的累积。本研究为阐明橡胶树花青素代谢途径奠定基础。

橡胶树花青素合成调控因子HbAn1的克隆及其功能分析

橡胶树转基因过程筛选效率低阻碍了转基因研究快速发展。花青素累积产生的紫红色肉眼直接可辨,是一种简单、安全的可视化筛选标记。为利用橡胶树花青素作为转基因筛选标记,本文首先以R2R3-MYB保守结构域(R2、R3)为探针调取橡胶树R2R3-MYB,并与拟南芥等其他物种花青素合成相关的R2R3-MYB进行进化分析,结果显示橡胶树scaffold0374_923317和Scaffold0598_393375与其他物种已功能验证的花青素合成调控R2R3-MYB聚到同一亚类。随后从古铜期叶片中克隆到scaffold0374_923317基因,并将其命名为HbAn1。序列分析表明,HbAn1蛋白具有R2R3-MYB蛋白的典型结构:R2R3结构域及b HLH互作结构域。定量表达分析表明HbAn1在古铜期叶片及暗培养茎秆中高水平表达,在其他时期叶片及光照培养茎秆中表达水平很低,与不同组织花青素含量正相关。最后,在烟草中组成型过表达HbAn1,使烟草叶片、花瓣、花托、花丝等组织大量累积花青素,定量分析表明其激活了这些组织后期花青素合成酶基因Nt DFR,Nt LDOX,Nt UFGT。本文首次获得橡胶树花青素累积相关的正调控因子R2R3-MYB(HbAn1),这为花青素作为橡胶树转基因可视化筛选标记提供了基因资源。