旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的 获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。 方法 以旋毛虫感染猪血清为抗体探针 ,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将获得的阳性克隆进行测序及分析。 结果 从 4 5× 10 5旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得 15 8个阳性克隆。序列分析结果表明 ,其中有 3 6个新的cDNA序列 ,已报道的序列有 5个 ,有 12个序列无开放阅读框架 (ORF) ,与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的 获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。 方法 旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入 PET- 2 8a(+)表达载体 ,异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物 ,SDS- PAGE、 EL ISA和 Western blotting对表达产物进行分析鉴定 ,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果 SDS- PAGE结果显示 ,表达产物为分子量约为 4 0 k Da的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别 ,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。 结论 获得一个新的旋毛虫成虫 Ts87基因重组蛋白 ,该蛋白具有特异的抗原性。

旋毛虫新生幼虫T668重组抗原对小鼠的保护性免疫

目的 研究旋毛虫新生幼虫T6 6 8重组抗原的免疫原性 ,制备基因工程疫苗。方法 以旋毛虫新生幼虫期特异性基因T6 6 8在大肠杆菌中的表达蛋白为抗原免疫小鼠 ,每间隔 10d免疫 1次 ,共免疫 3次。末次免疫后 10d ,每只小鼠攻击感染 2 0 0条旋毛虫感染性肌幼虫 ,感染后 5周用消化法检查肌幼虫 (ML)负荷。结果 T6 6 8重组抗原免疫组肌幼虫减虫率明显高于佐剂组和对照组。结论 T6 6 8重组抗原能诱导小鼠产生一定程度的保护性免疫 ,且可激发特异性体液免疫。

旋毛虫G10-7基因在大肠杆菌中的高效表达

旋毛虫新生幼虫期特异性 G10 - 7基因从 PBK- CMV- G10 - 7重组质粒中亚克隆到 p ET- 2 8b(+)原核表达载体上 ,成功地构建了重组表达质粒 p ET- 2 8b- G10 - 7。将其转化到大肠杆菌 DE3感受态细胞中 ,经 IPTG诱导表达 ,其细菌裂解物经 SDS- PAGE电泳可检测到相对分子质量约为 34 0 0 0的目的蛋白带 ,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加 ,诱导 4h达到峰值 ,薄层扫描结果显示 ,目的蛋白占菌体总蛋白的 6 1.7%。Western- blotting检测显示 ,此蛋白可被感染旋毛虫家猪阳性血清所识别 ,表明该蛋白具有良好的抗原性。

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的 构建和表达旋毛虫重组质粒。方法 PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论 成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。

以重组蛋白为抗原的ELISA法检测旋毛虫抗体

目的寻求特异性强、敏感性高的旋毛虫病诊断抗原。方法以旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在E.coli高效表达的重组蛋白为抗原,分别以兔、猪和健康者血清及旋毛虫病阳性血清为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、山羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗,建立检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法,并以旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(ES)抗原作为检测对照。结果以T668重组蛋白为抗原,对兔、猪和人旋毛虫病血清进行检测,阳性检出率为100%,且敏感性高(0.016μg/孔),与ES抗原检测结果完全一致。结论T668重组抗原有望替代ES抗原检测旋毛虫抗体。

旋毛虫抗原基因Ts88的克隆及鉴定

目的 获取旋毛虫具有抗原性的新基因。方法 应用旋毛虫免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库约 3× 10 5重组噬菌斑进行筛选。基因克隆、DNA测序及 5′ -RACE获cDNA全长 ;采用ESEE、DNAstar软件及核苷酸序列数据库 (GenBank)进行cDNA序列分析。结果与结论 免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 3个阳性克隆。其中的Ts88克隆cDNA全长为 196 6bp ,编码 4 84个氨基酸 ,含有一个PWWP功能结构域及多个抗原表位。Ts88cDNA是一个尚未见报道的旋毛虫抗原新基因。

旋毛虫成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析

目的 获取编码旋毛虫5日龄成虫(AD5)期特异性基因完整开放阅读框架(open reading frame,ORF)cD-NA分子。方法 利用地高辛标记的AD5期特异性cDNA片段T671作为探针对AD5 cDNA文库进行核酸杂交筛选,将筛选出的阳性克隆进行测序,利用分子生物学软件进行分析。结果 获得1个全长1132bp的cDNA分子,该cD-NA含有1个1032bp完整的ORF,该ORF编码1个343个氨基酸残基组成的多肽,其分子量理论推导值为35.1kDa,等电点(isoelectric point,IP)为4.8。InterProScan分析显示117～120氨基酸残基(SGYG)为粘多糖结合位点,27～86氨基酸残基为一线虫表皮胶原蛋白N-末端区结构域,153～328氨基酸残基为胶原蛋白螺旋三联体重复区(G-x-y)结构域。Signal PV2.0分析显示,在1～43氨基酸区域为信号肽。Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA分子。但与表皮胶原蛋白同源性较高,大于40％。结论 筛选获得一个新的编码AD5期特异性基因的完整ORF的cDNA分子。

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的 获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。 方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。 结果 免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。 结论 筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。

旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的对旋毛虫新生幼虫期特异性T668cDNA进行表达及鉴定,以获得基因工程抗原。方法应用PCR技术,从pBK CMV T668重组质粒中扩增到不含信号肽序列的T668cDNA片段,将目的基因克隆于原核表达载体pET28a(+),构建pETT668重组质粒,再将其转化到E.coli表达菌株DE3感受态细胞中,经IPTG诱导表达,以SDS PAGE鉴定表达产物。结果pETT668表达蛋白的分子质量单位为49ku,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加,诱导5h时表达量达到高峰;薄层扫描结果显示,目的蛋白占菌体总蛋白的34.6%。Western blotting检测显示,表达蛋白可被感染旋毛虫家猪血清所识别。结论旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在大肠埃希菌中获得高效表达,且表达蛋白具有良好的抗原性。