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牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证 被引量:1
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作者 覃鸿妮 谢钰珍 +3 位作者 薛高旭 梅啸 沈为琴 蔡一林 《西南大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期24-31,共8页
从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受... 从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后,纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明:BL21(DE3),ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常,且未纯化到目的蛋白,BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常,但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白,IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证,酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA,酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散,表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA. 展开更多
关键词 DNaseⅠ 基因合成 基因表达 基因功能验证
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利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株 被引量:1
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作者 覃鸿妮 谢钰珍 +1 位作者 马傲 蔡一林 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期741-750,共10页
【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子... 【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。 展开更多
关键词 CRISPR/Cpf1 ABCG1 ABCG4 基因敲除 稳定细胞株
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慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证
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作者 覃鸿妮 谢钰珍 +3 位作者 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第2期246-251,共6页
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、... 【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT108002-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。 展开更多
关键词 CRISPR/Cpf1 慢病毒载体 细胞系 基因编辑
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高表达抗PD-1单克隆抗体细胞株工艺开发的研究 被引量:1
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作者 张勇 覃鸿妮 +1 位作者 谢钰珍 王倩文 《生物化工》 2019年第4期9-13,共5页
以PD-1分子为靶点,以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为宿主,构建高表达抗PD-1单克隆抗体的细胞株,优化细胞株筛选工艺,优化工艺参数,得到稳定高表达PD-1细胞株。运用悬浮细胞CHO表达抗PD-1的抗体,首先在质粒构建中,将重链和轻链插到同一个载体上... 以PD-1分子为靶点,以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为宿主,构建高表达抗PD-1单克隆抗体的细胞株,优化细胞株筛选工艺,优化工艺参数,得到稳定高表达PD-1细胞株。运用悬浮细胞CHO表达抗PD-1的抗体,首先在质粒构建中,将重链和轻链插到同一个载体上,保证了重链和轻链的比例为1∶1,实现共表达,轻重链在一个载体上,再同PD-1基因共转染,对后面的基因扩增筛选提供基础。采用悬浮培养,使用化学成分确定的培养基CD培养基,支持重组CHO细胞的生长,达到高密度培养,从而得到高表达蛋白。结果表明蛋白表达量稳定性分析表明,筛选出两株表达量较高的细胞株,表达量分别达到2.03g/L和2.09g/L,为抗PD-1抗体的生产提供了稳定高产的细胞系。得到了稳定高表达PD-1细胞株,且蛋白质量与原研药一致。 展开更多
关键词 PD-1 单克隆抗体 细胞株 工艺开发
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限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的合成、克隆与表达
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作者 谢钰珍 覃鸿妮 +1 位作者 张勇 赵文玮 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期534-539,共6页
【目的】核酸外切酶I(Exonuclease 1,EXO1)是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并... 【目的】核酸外切酶I(Exonuclease 1,EXO1)是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化。【方法】采用重叠PCR合成sbcB基因,通过酶切将其克隆至表达载体pET-30a上并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,获得限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白EXO1,大小与预测的54.5 KD相符;以S1核酸外切酶为对照进行的功能验证证实:sbcB基因表达产物EXO1能够消化单链,但不会消化双链,纯化的EXO1具有很好的酶活性。【结论】依据本文方案制备的限制性外切酶Ⅰ(EXO1)产量高、纯度高,适用于实验室测序前PCR产物的处理。 展开更多
关键词 EXO1 sbcB基因 核酸外切酶 基因表达
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Syntheses, Structures and Photocatalytic Degradation Properties of Two Copper(Ⅱ) Coordination Polymers with Flexible Bis(imidazole) Ligand 被引量:3
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作者 ZHANG Yong qin hong-ni +1 位作者 LI Bao-Long WU Bing 《Chinese Journal of Structural Chemistry》 SCIE CAS CSCD 2021年第5期595-602,528,共9页
Two copper(Ⅱ) coordination polymers {[Cu(bib)(nip)]·1.5 H_(2)O}_(n)(1) and [Cu_(2)(bib)(glu)_(2)]_(n)(2)(bib = 1,4-bis(2-methyl-imidazol-1-yl)butane, H2nip = 5-nitroisophthalic acid, H2glu = glutaric acid) were ... Two copper(Ⅱ) coordination polymers {[Cu(bib)(nip)]·1.5 H_(2)O}_(n)(1) and [Cu_(2)(bib)(glu)_(2)]_(n)(2)(bib = 1,4-bis(2-methyl-imidazol-1-yl)butane, H2nip = 5-nitroisophthalic acid, H2glu = glutaric acid) were synthesized by the hydrothermal method and characterized by single-crystal X-ray diffraction, elemental analyses, IR and solid-state diffuse-reflection spectra. 1 forms a 2D network with the point symbol of(4~4·6^(2)) and 2D → 2D polythreaded network. 2 constructs the 6-connected 3D network based on the [Cu_(2)(COO)_(2)] dimer with the point symbol of(4~4·6~(10)·8). The energy band gaps(Eg) of 1 and 2 were 2.453 and 2.162 eV, respectively. 1 and 2 present high photocatalytic activity for the degradation of methylene blue under visible light irradiation. 展开更多
关键词 coordination polymer structure 3D network photocatalysis 1 4-bis(2-methyl-imidazol-1-yl)butane
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