西洋参抗心脏肥大的网络药理学分析和实验验证研究

目的:通过网络药理学探讨西洋参多成分、多靶点、多通路的抗心脏肥大作用机制,并选取关键靶点进行细胞实验验证。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中医药百科全书(ETCM)、有机小分子生物活性数据库(PubChem)、多靶点定量构效关系的靶点预测平台数据库(Targetnet)、小分子药物靶点预测在线平台(Swiss Target Prediction)等数据库及参考文献筛选西洋参活性成分及作用靶点。通过人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、药物靶标数据库(TTD)及基因名片数据库(GeneCards)筛选心脏肥大相关靶点。将药物的作用靶点与疾病靶点进行交集,获得药物-疾病共同靶点,利用STRING数据库构建PPI网络图,并借助Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析,采用注释、可视化和综合发现(DAVID)数据库对重要靶点进行基因本体(GO)功能与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。进一步采用异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大模型,观察西洋参抗心肌细胞肥大作用,逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测关键靶点的基因表达。结果:从西洋参中筛选出42个活性成分,能够作用于41个心脏肥大相关靶点,其中血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等21个靶点是关键靶点,主要涉及一氧化氮合成过程的正调控、脂多糖介导的信号通路、肽基-丝氨酸磷酸化的正调控,参与调节癌症蛋白多糖、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路等。进一步细胞实验结果表明,西洋参100.0μg/mL可抑制异丙肾上腺素10μmol/L诱导的心肌细胞肥大(P<0.05)。在异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大模型中,VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1 mRNA表达上调(P<0.05),西洋参可明显抑制上述关键靶点基因表达上调(P<0.05)。结论:西洋参抗心脏肥大的作用机制可能与下调VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1等多个靶点的基因表达有关。

基于体外细胞实验和网络药理学研究乳香挥发油抗心脏肥大的作用机制

目的:通过体外细胞实验和网络药理学方法探讨乳香挥发油抗心脏肥大的作用机制。方法:通过异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导的H9c2心肌细胞肥大模型研究乳香挥发油抗心脏肥大的作用。通过CNKI、Pubmed、Pubchem等数据平台检索筛选并收集乳香挥发油活性成分、作用靶点及心脏肥大疾病靶点;利用String数据库和Cytoscape 3.8.0软件构建乳香挥发油抗心脏肥大蛋白互作(PPI)网络和乳香挥发油“药物-活性成分-关键靶点-疾病”网络,筛选分析乳香挥发油抗心脏肥大的关键靶点,并采用荧光定量PCR实验进行关键靶点的验证。通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。结果:体外细胞实验表明乳香挥发油可抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞表面积增大、蛋白合成增加以及心脏肥大相关胚胎基因心房钠尿肽(ANP)、β-MHC mRNA表达上调。基于文献筛选乳香挥发油有效成分86种,抗心脏肥大靶点36个。网络分析雌激素受体1(ESR1)、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)是关键靶点,荧光定量PCR结果显示乳香挥发油抑制ISO诱导的心肌细胞ESR1、PTGS2、TNF、MAPK14 mRNA水平上调,NOS3、PPARG mRNA水平下调。GO功能富集分析主要涉及脂多糖介导的信号通路、一氧化氮生物合成过程的正调控、质膜穴样内陷、酶结合等。KEGG通路富集分析包含通路22条,主要与VEGF signaling pathway,TNF signaling pathway,Sphingolipid signaling pathway等相关。结论:乳香挥发油活性成分可能是通过作用于ESR1、NOS3、PTGS2、TNF、MAPK14、PPARG等关键靶点,调节VEGF signaling pathway,TNF signaling pathway,Sphingolipid signaling pathway等途径,影响脂多糖介导的信号通路、一氧化氮生物合成过程的正调控、质膜穴样内陷、酶结合等改善心脏肥大。

基于脾脏代谢组学研究肿节风总黄酮治疗免疫性血小板减少症的作用机制

目的运用代谢组学技术研究肿节风总黄酮干预免疫性血小板减少症(ITP)的作用机制。方法48只雄性SD大鼠使用Excel随机函数分为正常对照组,模型组,肿节风总黄酮低、中、高剂量组和醋酸泼尼松龙组,每组8只。除正常对照组外,其他各组大鼠第1、3、4、6、7、8天腹腔注射兔抗大鼠血小板血清(5 mL/kg)复制ITP大鼠模型,正常对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。造模日同时给药干预,每日1次。肿节风总黄酮低、中、高剂量组分别灌胃肿节风总黄酮(31.5、63.0、94.5 mg/kg),醋酸泼尼松龙组腹腔注射醋酸泼尼松龙(10.0 mg/kg)。第0、3、6、9天检测各组大鼠外周血小板数量,第10天称量脾脏质量,并计算脾脏指数。利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱技术和多元统计分析对各组大鼠脾脏差异代谢物进行筛选和鉴定,并进行通路富集分析。结果与正常对照组比较,模型组大鼠第6、9天外周血小板减少,脾脏质量增加,脾脏系数升高(P<0.05)。与模型组比较,肿节风总黄酮低、中、高剂量组第6、9天外周血小板数量增加,肿节风总黄酮高剂量组脾脏质量减少,肿节风总黄酮中、高剂量组脾脏指数降低(P<0.05)。脾脏代谢组学分析筛选得到24种与ITP相关的生物标志物,肿节风总黄酮高剂量组可以回调其中的21种,主要涉及亚油酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢。结论肿节风总黄酮可能通过调节脾脏亚油酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢等代谢通路恢复免疫系统的正常调节能力,以抑制血小板过度破坏,发挥治疗ITP的作用。

肿节风总黄酮调节MAPK/JNK信号通路促进巨核细胞分化成熟

目的 基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/c-Jun N-末端激酶(JNK)信号通路探讨肿节风总黄酮对体外巨核细胞分化成熟障碍模型的影响及作用机制。方法 利用终浓度为5 ng·mL^(-1)的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和体积分数为1%的抗血小板血清(APS)联合作用于Dami细胞,构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型。将细胞分为空白对照组、PMA诱导组(5 ng·mL^(-1))、APS模型组(5 ng·mL^(-1)PMA+1%APS)以及肿节风总黄酮高、中、低剂量组(15.6、7.8、3.9μg·mL^(-1)肿节风总黄酮+5 ng·mL^(-1)PMA+1%APS)。分别于培养48、72、96 h后,采用化学发光法检测细胞增殖活力。培养96 h后,采用流式细胞术检测各组Dami细胞的巨核细胞表面标志物CD41a、CD42b和CD61表达情况;采用Western Blot法检测Dami细胞MAPK/JNK信号通路关键蛋白p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun的表达情况。结果 (1)与空白对照组相比,PMA诱导组不同时间点的细胞活力均显著降低(P<0.01);与PMA诱导组相比,APS模型组48 h的细胞活力明显下降(P<0.05),但随时间延长抑制作用减弱,72、96 h的差异无统计学意义(P>0.05);与APS模型组比较,肿节风总黄酮中、高剂量组48、72 h的细胞活力均受到明显抑制(P<0.05,P<0.01),肿节风总黄酮高剂量组96 h的细胞活力受到显著抑制(P<0.01)。(2)与空白对照组比较,PMA诱导组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著升高(P<0.01)。与PMA诱导组比较,APS模型组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著降低(P<0.01);p-JNK/JNK及p-c-Jun/c-Jun蛋白表达显著上调(P<0.01)。与APS模型组比较,肿节风总黄酮高、中剂量组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著升高(P<0.01),细胞p-JNK/JNK蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01);肿节风总黄酮低、中、高剂量组Dami细胞p-c-Jun/c-Jun蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论 肿节风总黄酮可能通过调节MAPK/JNK信号通路来改善巨核细胞分化成熟障碍。

养阴化瘀解毒方通过PI3K/Akt信号通路调控低氧环境下结肠癌细胞的自噬和凋亡

目的:观察不同氧浓度环境对结肠癌细胞增殖、自噬的影响,并基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路探讨养阴化瘀解毒方在低氧环境下对结肠癌细胞自噬及凋亡的影响。方法:HCT-116细胞分为常氧组、1%低氧组、5%低氧组,通过细胞增殖与毒性检测(MTS)法检测细胞存活率,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察不同氧浓度下细胞自噬荧光表达情况;在5%低氧微环境下用养阴化瘀解毒方干预HCT-116细胞,分为正常组、空白血清组、养阴化瘀解毒方组(养阴化瘀解毒方含药血清5%、15%、25%);通过MTS法计算各组细胞的抑制率;单丹磺酰尸胺(MDC)染色检测各组自噬细胞率的变化;利用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)流式细胞术检测各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同组自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)、酵母Atg6同源物(Beclin-1)、泛素结合蛋白(p62)和凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP-3)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、活化的胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和通路蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)表达情况。结果:与常氧组比较,1%、5%低氧组细胞存活率均明显上升,以5%低氧组细胞存活率提升幅度最大(P<0.01);与常氧组比较,1%、5%低氧组细胞自噬荧光强度均明显增强,且以5%低氧环境下MDC染色自噬荧光表达最强;低氧环境下,与空白血清组比较,养阴化瘀解毒方组(15%、25%)细胞抑制率明显提高、自噬细胞率降低、细胞凋亡率升高(P<0.01);养阴化瘀解毒方组(15%、25%)Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05);与养阴化瘀解毒方组(5%)比较,养阴化瘀解毒方组(25%)Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05);与空白血清组比较,养阴化瘀解毒方组(5%、15%、25%)LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01);养阴化瘀解毒方组(15%、25%)p62蛋白表达升高(P<0.01);与养阴化瘀解毒方低剂量组比较,养阴化瘀解毒方组(25%)p62蛋白表达升高(P<0.05);与空白血清组比较,养阴化瘀解毒方组(25%)促凋亡蛋白BNIP-3、Bax表达升高,抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.01);与养阴化瘀解毒方组(5%)比较,养阴化瘀解毒方组(25%)Bax蛋白表达上升(P<0.05);与空白血清组比较,养阴化瘀解毒方组(15%、25%)低氧因子HIF-1α表达降低(P<0.01);养阴化瘀解毒方组(25%)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达上升(P<0.05,P<0.01);与养阴化瘀解毒方中剂量比较,养阴化瘀解毒方组(25%)p-Akt/Akt表达上升(P<0.05)。结论:低氧微环境能明显促进结肠癌细胞自噬及增殖,发挥细胞保护作用,养阴化瘀解毒方在5%低氧环境下能明显抑制结肠癌细胞自噬和增殖,并促进细胞凋亡,其机制可能与上调PI3K/Akt信号通路有关。

Liver metabolomic characteristics in three different rat models of Yin deficiency based on ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry

OBJECTIVE:To investigate the mechanism of Yin deficiency syndrome(YDS) by analyzing the liver metabolomic characteristics of three different Yin deficiency rat models METHODS:Following the TCM etiology,for clinical features and pathological manifestations of modern medicine,three kinds of animal models of Yin deficiency were induced and replicated.Totally 48 Sprague-Dawley(SD) male rats were randomly divided into blank group,irritation induced model group,Fuzi-Ganjiang induced model group,and thyroxine-reserpine induced model group.After successful development of model,the ultraperformance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry was carried out to detect metabolites in each group.The metabolites of rat liver were analyzed for the characteristics of their biomarkers.The pathway enrichment analysis and metabolic network construction were performed through various online databases including Metabolite Biology Role,Human Metabolome Database,MetaboAnalyst,and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.RESULTS:The SD rats in the experimental group showed symptoms like less weight gain,reduced diet and water intake,high body temperature,increased liver and kidney indexes,and abnormal liver and kidney tissue morphology.Moreover,the rats showed high increased levels of serum cyclic adenosine monophosphate,estradiol,alanine transaminase,and aspartate aminotransferase and decreased levels of cyclic guanosinc monophosphate and testosterone.We found four key interrelated metabolic pathways in the liver tissue metabolomics,including the biosynthesis of pantothenic acid and coenzyme A,and metabolism of alpha-linolenic acid metabolism,glycerophospholipid metabolism,and sphingolipid.CONCLUSION:The liver and kidney YDS is closely related to the biosynthesis of pantothenic acid and CoA and abnormal metabolism of α-linolenic acid,glycerophospholipid,and sphingolipid in SD rats.

基于转录组学分析肿节风总黄酮抑制白血病K562细胞生长的作用机制

目的 利用转录组学技术结合体外实验揭示肿节风总黄酮抑制白血病K562细胞生长的作用机制。方法 将K562细胞分为空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)对照组及肿节风总黄酮低、中、高剂量组(25、50、100μg·mL^(-1)),干预48 h后采用化学发光法检测K562细胞活力。运用转录组测序(RNA-seq)技术对DMSO对照组和肿节风总黄酮高剂量组(100μg·mL^(-1))K562细胞进行差异表达基因(DEGs)分析;并对差异表达基因进行基因本体论(GO)功能及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。采用Western Blot法和流式细胞术验证筛选出的MAPK通路中关键蛋白的表达情况,以及细胞周期变化。结果 与DMSO对照组比较,肿节风总黄酮低、中、高剂量能够显著抑制K562细胞活力(P<0.01)。转录组分析共筛选出989个差异表达基因,其中654个上调、335个下调。KEGG通路富集分析显示,肿节风总黄酮对K562细胞的作用与MAPK信号通路、神经活性配体-受体相互作用、补体和凝血级联途径高度相关。与DMSO对照组比较,高剂量肿节风总黄酮能够显著降低K562细胞的p-JNK、CDC20蛋白表达水平(P<0.01),升高P53、CDKN1A蛋白表达水平(P<0.01),明显阻滞K562细胞在G0/G1期(P<0.01)。结论 肿节风总黄酮可能通过降低MAPK信号通路中JNK蛋白磷酸化水平,上调P53、CDKN1A蛋白表达,下调CDC20蛋白表达,阻滞细胞周期,进而抑制白血病K562细胞的生长活性。

基于RNA测序的太赫兹波抑制白血病K562细胞转录组学特征分析

为了探究太赫兹波抑制K562细胞存活率基因表达变化的整体情况,揭示其可能的关键信号通路,利用太赫兹波干预K562细胞,基于RNA测序分析基因表达变化的整体差异,通过生物信息学方法分析差异表达基因的富集与聚类特征。以一定的条件筛选出1131个差异表达基因,包括上调表达基因216个,下调表达基因915个。基因本体论富集分析结果表明,差异表达基因主要富集在DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶与DNA结合、转录因子活性、蛋白质折叠、共价染色质修饰和组蛋白修饰等过程中。京都基因和基因组百科全书的信号通路分析结果表明,差异表达基因主要富集在丝裂原活化蛋白激酶、C型凝集素受体、Notch、Janus激酶信号转导及转录激活因子和转化生长因子-β等与K562细胞增殖和凋亡密切相关的信号通路。本研究对揭示太赫兹波对生物体效应的影响具有一定的参考价值。

苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大的作用研究

目的探究苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大的保护作用及机制。方法 (1)体外培养大鼠H9c2心肌细胞,采用MTT法评价不同浓度的异丙肾上腺素(0.625、1.25、2.5、5、10μmol·L-1)和不同浓度的苦瓜皂苷L(1.625、3.125、6.25、12.5、25.0μg·mL^(-1))对心肌细胞活力的影响。(2)采用异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大模型。实验分为正常组、模型组、苦瓜皂苷L干预组和苦瓜皂苷L单独组。分别通过细胞拍照结合ImageJ软件测量、荧光定量PCR法考察苦瓜皂苷L 12.5μg·mL^(-1)对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞表面积和心肌肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC及α-SKA表达的影响。在此基础上,选择参与甘油磷脂代谢的酶VI组磷脂酶A2(PLA2G6)、二酰甘油激酶ζ(DGKZ)、甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶1(GPCPD1)为指标,评价苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞上述3种酶基因表达的影响;进一步以PLA2G6和DGKZ蛋白为指标,采用Western Blot法考察苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞PLA2G6和DGKZ蛋白表达的影响。结果 (1)与正常组比较,异丙肾上腺素(0.625~10μmol·L-1)和苦瓜皂苷L(1.625~25μg·mL^(-1))对心肌细胞活力没有明显影响(P>0.05)。本研究选用异丙肾上腺素10μmol·L^(-1)和苦瓜皂苷L 12.5μg·mL^(-1)进行实验。(2)与正常组比较,模型组心肌细胞表面积增加(P<0.05),心肌肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC、α-SKA表达上调(P<0.05),PLA2G6、DGKZ、GPCPD1 mRNA表达上调(P<0.05),PLA2G6和DGKZ蛋白表达增加(P<0.05);与模型组比较,苦瓜皂苷L干预组能够降低心肌细胞表面积(P<0.05),下调心肌肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC、α-SKA表达(P<0.05),下调PLA2G6、DGKZ、GPCPD1 mRNA表达(P<0.05),降低PLA2G6和DGKZ蛋白表达(P<0.05)。结论苦瓜皂苷L可缓解异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大,可能与其抑制甘油磷脂代谢酶PLA2G6和DGKZ的表达有关。