广西某猪场猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

为获得猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)并初探其病原特性,利用PCR方法检测广西贵港某猪场送检的死亡仔猪病料,随后将组织悬液接种PK-15细胞分离病毒,传到F4代后进行病毒效价测定及小鼠感染试验。结果表明,病料经PCR检测发现呈PRV核酸阳性,组织悬液接种PK-15细胞后,细胞出现固缩、变圆、脱落,形成小合胞体等细胞病变,测定F4代PRV的半数组织细胞感染量(TCID 50)为1×10^(-7).66/100μL,感染的昆明小鼠出现了奇痒、啃咬注射处、皮肤出血甚至死亡等。成功分离得到1株猪伪狂犬病病毒并初探了其病原特性,为今后广西地区猪伪狂犬病病毒的相关研究积累了材料。

水牛KDM1A/LSD1基因的克隆分析及真核表达载体的构建

本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。

LBP基因沉默对LPS诱导水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响

为了探讨抑制脂多糖结合蛋白(LBP)基因表达对水牛单核巨噬细胞在内毒素(LPS)诱导下炎症相关基因的表达,首先采用三质粒慢病毒包装系统包装LBP基因shRNA重组质粒pSicoR-GFP-shLBP774.利用病毒颗粒感染水牛单核巨噬细胞,进行荧光定量qRT-PCR及ELISA检测.结果显示,单核巨噬细胞在用5×108 IU/mL滴度的LBP-shRNA774慢病毒颗粒,感染指数(MOI)为300、感染7d的条件下,感染效率超过50%.qRT-PCR检测结果显示,与LPS对照组相比,shLBP774感染组可极显著抑制LBP基因的表达(p<0.01),CD14,TLR4,TNF-α,IL-1β,IL-8等基因表达显著降低(p<0.05).ELISA检测结果发现,与对照组相比,细胞分泌的TNF-α,IL-1β蛋白量显著降低(p<0.05).以上结果表明,抑制LBP基因表达可以有效降低LPS诱导下单核巨噬细胞炎症相关基因的表达,进而调控LPS引发的炎症反应,提示可将LBP作为靶基因深入研究水牛单核巨噬细胞免疫功能和LPS致炎信号传导分子机制.

马MC1R基因多态位点与毛色相关性分析

旨在研究马MC1R基因多态位点与马毛色的关联性,为马的毛色育种提供重要的理论参考依据。本研究采集了10种不同毛色共132匹马的颈静脉血,提取基因组并应用PCR技术克隆MC1R基因编码序列,通过限制性长度多态性(RFLP)分析和测序分析,对马MC1R基因多态性与毛色进行关联分析,并预测了SNPs对其编码蛋白结构的影响。构建和分析了MC1R基因的系统发育树。结果发现,马MC1R基因存在3个多态位点,其中c.G102A为同义突变,c.C248T和c.G250A为错义突变。c.C248T造成MC1R蛋白的第83个氨基酸由极性亲水丝氨酸变为非极性疏水苯丙氨酸,预测突变后该位点氨基酸与第三跨膜区的第127个氨基酸(丝氨酸)之间的氢键消失而改变了MC1R的蛋白构象,该突变导致MC1R基因出现EE、Ee和ee 3种基因型。错义突变c.G250A导致其翻译的氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺,该位点突变后与邻近氨基酸及跨膜域作用力复杂,推测比只出现c.C248T突变对MC1R蛋白功能的影响要小,该位点突变导致出现基因型ee^a。综合NCBI中的马MC1R基因型数据(共571匹)与其毛色性状进行相关性分析发现,在骝毛马和黑毛马群体中存在EE和Ee两种基因型,青毛马群体中存在EE、Ee、ee和ee^a基因型,栗毛中存在ee和ee^a两种基因型。黑毛和骝毛马的基因型分布差异极显著(P<0.01),呈现Hardy-Weinberg不平衡,等位基因E为优势等位基因;在栗色马中未检测到E等位基因,e为优势等位基因。MC1R基因系统发育树分析显示,EE基因型个体与家马、普氏野马相似性最高。本研究结果显示,马MC1R多态位点产生的不同基因型与马的骝毛、黑毛、栗毛及以这3种毛色为基础毛色的花马毛色存在相关性,骝毛马与黑毛马中不存在基因型ee,栗毛马中则不存在等位基因E。为应用基因型对马的毛色进行定向选择育种奠定了基础。

水牛Novel-miR-57对Bcap-37和BMECs细胞DOK4基因的调控作用

【目的】筛选Novel-miR-57调控靶基因,并明确其对靶基因的调控作用及生物功能,为揭示水牛乳腺上皮细胞(BMECs)的分化机理提供科学依据。【方法】利用MiRscan预测Novel-miR-57二级结构;以自编软件Ensembl(v80)注释的水牛mRNA截取3'-非翻译区(3'-UTR)作为预测数据库,采用Miranda(v3.3a)对Novel-miR-57进行靶基因预测;运用实时荧光定量PCR筛选重点靶基因。以化学合成的Novel-miR-57模拟物Mimics和抑制剂Inhibitor,分别转染人类乳腺癌细胞(Bcap-37)及BMECs细胞,以验证Novel-miR-57与靶基因的表达相关性。【结果】Novel-miR-57前体序列形成7个茎环结构,成熟序列位于第1、2和3个茎环结构间,其结合自由能为-53.70 kcal/mol。以结合自由能低于-20.00 kcal/mol为标准,最终筛选出34个可能的靶基因,共与42条KEGG信号通路存在关联,其富集的信号通路主要有代谢通路(ID:bta01100)、PI3K-Akt信号通路(ID:bta04151)、MAPK信号通路(ID:bta04010)和细胞因子—细胞因子受体相互作用(ID:bta04060)等;经实时荧光定量PCR检测分析发现DLX3、CANCNG3、DOK4、NFKBID、C17orf53、RTN1和FBXO10等7个靶基因在非泌乳期的相对表达量极显著高于泌乳期(P<0.01),二者间相差100.0倍以上,且与NovelmiR-57的相对表达量呈负相关。7个靶基因中仅DOK4基因与Novel-miR-57的表达具相关性,以200 nmol/L Inhibitor转染B-cap37细胞能显著提高DOK4基因表达(P<0.05,下同),添加100 nmol/L Mimics则显著抑制DOK4基因表达。以100 nmol/L Mimics转染BMECs细胞,Novel-miR-57和DOK4基因的相对表达量显著提高;而以200 nmol/L Inhibitor转染BMECs细胞,Novel-miR-57和DOK4基因的表达均受到显著抑制。【结论】Novel-miR-57含有7个茎环结构,且其成熟序列位于第1~3个茎环上。Novel-miR-57过表达可下调Bcap-37细胞DOK4基因表达或上调BMECs细胞DOK4基因表达,即Novel-miR-57对靶基因的调控作用因乳腺细胞生理状态不同而存在差异。

关中奶山羊PIS区域序列多态性分析

山羊无角性状是畜牧业生产中重要的经济性状,报道显示山羊无角间性综合征(polled intersex syndrome,PIS)控制着山羊的无角和间性性状。山羊PIS序列定位于1号染色体约11.7kb的序列上,试验旨在研究这段序列对关中奶山羊(3只有角山羊、3只无角山羊)无角性状的影响。选用4对引物(PIS1-1、PIS1-2、PIS2、PIS3)扩增关中奶山羊的PIS序列,第5对引物(PIS whole)用于检测PIS序列的完全缺失,对测序结果进行拼接、多态性分析,并对序列进行基因注释。结果发现,试验成功扩增出山羊PIS的全长序列(12.814kb),BLAST比对结果正确。PIS whole引物没有扩增出任何条带,说明关中奶山羊中不存在11.7kb的完全缺失。经SeqMan软件分析拼接序列发现30个多态性位点,这些多态性位点可能与关中奶山羊有角/无角性状相关。对拼接序列进行基因注释,发现存在1个tRNA编码位点、2个微卫星、3个microRNA编码位点及L1-EN、RT-nLTR-like样保守结构域,并发现1个CpG岛、1对反向重复序列和2段串联重复序列。本试验结果对关中奶山羊无角性状的分子机理研究具有重要的参考价值。

水牛MYF5基因克隆分析及真核表达载体构建

本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。

饲养条件对水牛精液品质及精浆代谢物的影响分析

为了解饲养条件对意大利地中海种公牛精液品质及精浆代谢产物的影响,首先分析了青贮和青绿饲养条件下地中海种公牛的精液品质及生化指标,而后采用超高效液相色谱串联质谱技术对种公牛精浆进行非靶向代谢组分析.结果显示:与青贮饲料组相比,青绿饲料组种公牛精子活力和采精量显著升高、畸形率显著下降(p<0.05),精液pH值和密度没有显著差异(p>0.05).青绿饲料组种公牛精子直线速度、曲线速度、平均速度、鞭打频率均显著升高(p<0.05),精子直进性和直线性极显著升高(p<0.01),头部振幅没有显著差异(p>0.05);青绿饲料组种公牛精浆中镁(Mg^(2+))、果糖(Fructose)含量均显著升高(p<0.05),钾(K^(+))、睾酮(T)、α-葡萄糖苷酶(α-Glu)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢同工酶(LDH)含量极显著升高(p<0.01),钠(Na^(+))含量差异不显著(p>0.05).精浆代谢成分分析结果显示,本次组学数据共匹配出677个不同代谢物,筛选得到10种差异代谢物,它们参与了9条代谢通路.以上结果说明,营养条件的改变会对种公牛精液质量和生理代谢产生影响,并影响精浆代谢特征.

山羊同期发情和超数排卵方法概述

同期发情可以为山羊的集约化、工厂化生产提供保障,超数排卵是胚胎移植和山羊高产的必要保证。本文对山羊同期发情和超数排卵的几种常用方法进行概述,以期为我国各地区选择适合本地区山羊高产的处理方式提供思路。

SMYD3 对克隆猪早期胚胎发育的影响研究

目的:检测并分析SMYD3基因在猪卵母细胞体外成熟、孤雌激胚胎与体细胞核移植早期胚胎中的表达模式,研究SMYD3基因表达对猪核移植早期胚胎发育及多能性基因表达的影响.方法:通过在猪体细胞核移植胚胎中过表达和干扰SMYD3基因,观察卵裂率、四细胞率和囊胚率,并采用RT-qPCR检测不同处理组各时期SMYD3的表达情况以及多能性基因Nanog和Oct4的表达量.结果:qRT-PCR结果显示,SMYD3基因在猪卵母细胞体外成熟过程中表达较低;在孤雌激活和核移植早期胚胎发育过程中均呈现先升高后降低的表达规律,其中在4细胞和8细胞期胚胎中表达较高.过表达SMYD3基因显著提高猪核移植胚胎的囊胚率(14.63%vs 9.68%,p<0.05),下调SMYD3基因表达显著降低囊胚率(6.74%vs 9.68%,p<0.05).上调SMYD3组猪核移植囊胚Nanog和Oct4基因表达水平显著提高(p<0.05);下调组囊胚中Nanog基因检测不出,Oct4基因表达无显著差异.结论:上调SMYD3基因表达可提高猪体细胞克隆的囊胚发育率,提高核移植胚胎体外发育能力.

阿伐斯汀胶囊与自血疗法治疗慢性特发性荨麻疹的效果

目的:观察阿伐斯汀胶囊与自血疗法治疗慢性特发性荨麻疹的效果。方法:将2019年12月至2020年11月佛山市第一人民医院收治的70例慢性特发性荨麻疹患者纳入研究,以随机抽签法分成两组,对照组和观察组各35例。对照组采用阿伐斯汀胶囊口服治疗,观察组在对照组基础上联合自血疗法治疗,比较两组患者的治疗效果。结果:观察组患者治疗总有效率为97.14%,明显高于对照组的82.86%,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗前两组患者血清免疫球蛋白E(IgE)比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后观察组患者IgE水平低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗过程中均未见严重不良反应。结论:慢性特发性荨麻疹采用阿伐斯汀胶囊联合自血疗法治疗,可获得较好的治疗效果,且安全性高。

Variations of Reproductive Hormones of Female Swamp Buffalo from Guangxi Region in Off Season for Estrus

[Objective] The aim of this paper is to find the change law of reproductive hormones of female swamp buffalo in off season for estrus and to investigate the relationship between various hormones. [ Method] The concentrations of follicle stimulating hormone （FSH）, luteinizing hor- mone （ LH）, inhibin （ INH）, estradiol （ E2 ） and progesterone （ P4 ） were determined by the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） in off season for estrue. The changes of follicles in the estrous cycle were examined using B-mode ultrasonography. [ Result] In off season for estrus of female swamp buffalo from Guangxi region, the blood concentration of E2 and P4 varied fluctuantly. The concentration of E2 had two peaks, respec- tively 3 d before ovulation and after 13 d post ovulation. The concentration of P4 increased slowly from the first day after ovulation, increased rapidly from 5 to 13 d, peaked on Day 16 and decreased to the baseline 3 d before ovulation. The concentrations of FSH, LH and INH roached a peak re- spectively after 10 d post ovulation, 2 d before ovulation, and after 4 d post ovulation. The changes of the hormones had correlations. The concen- trations of FSH, LH and INH had highly significant correlations with each other, while the concentration of INH had highly significant correlations with that of E2 or P4- The concentration of E2 also had a highly significant correlation with that of P4- [ Conclusionl The study can guide the breeding of swamp buffalo from Guanqxi reqion and also help to improve their roproduction performance.

丝胶对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响研究

精液冷冻保存过程中精子易受氧化应激影响而导致解冻后精液品质下降。丝胶具有良好的抗氧化能力,在精液稀释液中添加丝胶可有效抑制活性氧积累导致的脂质过氧化,减缓精子氧化应激。为了解添加丝胶对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响,本研究在冷冻稀释液中添加不同浓度(0、0.25%、0.5%、1%)的丝胶,进行精液冷冻保存。检测冻后精子活力、质膜完整性、顶体完整性及精浆中谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)水平。结果表明,与未处理组相比,添加0.5%丝胶可提高地中海水牛冻后精子活力、质膜完整性、顶体完整性、GSH-Px酶活性、T-AOC水平(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。0.25%和1%丝胶添加组精子冻后活力、质量参数和抗氧化能力无显著性影响(P>0.05)。稀释液中添加0.5%丝胶时,冻后精子抗冻标志物HSP70蛋白表达水平极显著高于未添加组(P<0.01)。结果表明,在精液稀释液中加入0.5%丝胶可提高精液的抗氧化能力,使精子免受氧化应激损伤,有效改善地中海水牛精液冷冻后的品质。

过表达YY1对水牛早期胚胎发育及DNA甲基化的影响

为了解阴阳因子1(YY1)在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对早期胚胎发育和DNA甲基化的影响,本研究通过受精卵卵胞质注射的方法,将线性化处理的过表达YY1质粒注射到体外受精8~10 h的水牛受精卵中,分析其对水牛早期胚胎发育的影响,并在胚胎发育各个时期检测该基因的表达。同时通过qRT-PCR检测过表达YY1对DNMT1表达的影响来研究DNA甲基化水平。qRT-PCR结果表明,YY1和DNMT1在水牛植入前胚胎的表达模式呈相反的趋势,YY1的表达随着胚胎的发育逐渐增高,囊胚期达到最高,而DNMT1基因在桑葚胚前表达较高,囊胚期表达最低。与空白对照组相比,注射25μg/mL质粒对水牛囊胚发育率无显著影响(P>0.05),取得较高的表达EGFP囊胚(33.3%),显著高于5、15、50μg/mL处理组(P<0.05);处理组与空白对照组的胚胎分裂率、囊胚发育率、囊胚基因表达率差异均不显著(P>0.05)。过表达YY1胚胎在体外受精12 d后仍有囊胚产生。与空白对照组相比,处理组各时期胚胎中YY1和DNMT1表达量均有明显的增加。以上结果表明,过表达YY1对体外受精早期胚胎发育没有影响,但会延迟囊胚的形成。

毛壳素对猪核移植胚胎体外发育潜能的影响研究

为了解H3K9三甲基化表达水平对德保猪核移植胚胎发育潜能的影响,本试验使用毛壳素处理德保猪胎儿成纤维细胞,利用体细胞核移植技术观察猪核移植胚胎的体外发育和相关基因mRNA表达情况。结果显示,不同浓度毛壳素处理(20、30、50 nmol/L)德保猪成纤维细胞24 h时,20 nmol/L处理组的细胞生长曲线与未处理组相似,呈“S”型。实时定量PCR检测结果显示,20 nmol/L和30 nmol/L毛壳素处理均会显著降低SUV39H1/2和G9a在成纤维细胞中的表达(P<0.05)。核移植胚胎体外发育结果显示,与未处理组相比,20 nmol/L处理可显著提高核移植胚胎的4-细胞发育率和囊胚发育率(P<0.05);30 nmol/L处理的卵裂率、4-细胞发育率和囊胚发育率显著降低(P<0.05)。实时定量PCR检测结果显示,与未处理组相比,20 nmol/L处理可显著降低SUV39H1/2和G9a在2-细胞、4-细胞和8-细胞期核移植胚胎中的表达,显著提高2-细胞、4-细胞和核移植胚胎中eIF3A和TFIIA、囊胚中Nanog和Oct-4基因的表达(P<0.05)。研究结果表明:适宜浓度的毛壳素处理可降低德保猪核移植胚胎中H3K9me3的表达,提高核移植早期胚胎的发育潜能。

玻璃化冷冻对猪GV期卵母细胞及其DNA的影响

为了探索对猪GV期卵母细胞低毒性以及冷冻效果好的最佳冷冻保护液,并对玻璃化冷冻卵母细胞及其DNA损伤进行评价,本研究以猪GV期卵母细胞作为试验材料,应用玻璃化冷冻方法,就目前应用最多的六种冷冻保护液进行筛选,筛选出最合适的冷冻保护液;透射电镜观察冷冻卵母细胞超微结构的变化;采用彗星电泳技术检测玻璃化冷冻对卵母细胞DNA的影响。结果发现,以二甲基亚砜DMSO和乙二醇EG为主要成分的(HM+7.5%DMSO+7.5%EG)、HM+17%DMSO+17%EG+0.4 mol/L Su)冷冻保护液对猪GV期卵母细胞的损伤最小;玻璃化冷冻后卵母细胞透明带、细胞膜损伤,微绒毛消失,线粒体肿胀、基质不均、嵴不明显,胞质内溶解为絮状,有大量空泡;冷冻保护液处理组(未进行玻璃化冷冻)卵母细胞DNA损伤与对照组差异不显著,玻璃化冷冻组卵母细胞DNA损伤与冷冻保护液处理组和对照组均差异显著。结果表明,以DMSO和EG为主要成分的冷冻保护液适合用于对猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻,同时也证实了DNA的损伤主要是由玻璃化冷冻过程的机械损伤所致。

AQP9基因在不同闭锁进程水牛卵泡颗粒细胞中的表达及其与细胞凋亡关系的研究

为了解AQP9基因表达及其与水牛颗粒细胞凋亡的关系,初步阐明它在水牛卵泡闭锁中的作用,首先分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中AQP9基因和凋亡相关基因的表达情况。通过构建颗粒细胞凋亡模型、过表达AQP9基因的方法分析了它对细胞凋亡相关基因表达的影响。为进一步了解PKC通路与AQP9基因表达的相关性,添加PKC抑制剂处理水牛颗粒细胞,分析细胞凋亡和基因表达情况。上述研究结果表明,AQP9基因主要参与早期卵泡闭锁的过程,AQP9基因可能通过PKC信号通路调节水牛颗粒细胞的凋亡。

铁皮枫斗晶对人肠道微生物的影响

目的:运用高通量测序技术探究人体在服用铁皮枫斗晶后肠道微生物菌群的变化。方法:收集服用铁皮枫斗晶前后人群的粪便,利用高通量测序技术对两组粪便样本进行测序,从α、β多样性分析,T-test差异分析等角度分析铁皮枫斗晶对肠道微生物的影响。结果:与服用铁皮枫斗晶前比较,服用铁皮枫斗晶后肠道的物种种类显著增加。另外,对服用铁皮枫斗晶前后两组样本进行属水平上T-test分析发现,有39个菌属差异显著,其中21个菌属丰度显著下降,18个菌属丰度显著增高。结论:铁皮枫斗晶不仅可以通过增加短链脂肪酸生产的有益菌来抑制致病菌生长,从而发挥抗炎症作用,改善肠道内环境;还可以增加为宿主提供维生素B和维生素K的Melainabacteria纲菌的含量,此研究为中药及其保健食品的研究与开发提供新的路径。

沼泽型水牛KDM4A(JMJD2A)基因克隆分析与表达模式

旨在克隆并分析水牛赖氨酸特异性去甲基化酶4A(lysine-specific demethylase 4A,KDM4A)基因,并检测其在水牛不同组织中的表达情况,探讨KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能。提取卵巢组织的RNA,获得水牛KDM4A基因CDS区的全长序列。结果显示,水牛KDM4A基因编码区全长3151bp,编码1067个氨基酸。水牛KDM4A基因与黄牛、绵羊、骆驼和家犬的同源性分别为99%,97%,92%,91%;且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。KDM4A蛋白包含369个α-螺旋,85个β-转角,409个无规卷曲和204个延伸链,为亲水不稳定的酸性蛋白。qRT-PCR结果显示,KDM4A在水牛肌肉、肺脏、卵巢、大脑、皮肤、心脏、脾脏、肾脏和肝脏组织中均有表达,其中肌肉、肺脏、卵巢中表达量较高,肝脏和肾脏中表达量较低。本研究克隆得到了沼泽型水牛KDM4A基因,并对不同组织内KDM4A进行了基础的生物信息学分析,为阐明KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能,提高水牛胚胎发育水平提供理论基础。

水牛KDM4D基因克隆分析及其真核表达载体的构建

旨在克隆水牛组蛋白去甲基化酶KDM4D (lysine K-specific demethylase 4D)基因,对其进行生物信息学分析,并构建KDM4D基因的真核表达载体,为研究KDM4D基因在水牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎发育中的作用奠定基础。试验从水牛睾丸组织中提取总RNA,反转录cDNA后, RT-PCR技术克隆KDM4D基因片段,并运用生物信息学软件对序列进行分析;随后将KDM4D基因片段连接至真核表达载体pEGFP-C1,再把重组质粒转染进HEK293T细胞。结果表明,克隆所得的水牛KDM4D基因片段编码区全长1 155 bp,共编码384个氨基酸。水牛KDM4D基因与黄牛、山羊、绵羊、犬、猫、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为98.4%,96.6%,96.3%,84.9%,84.1%,81.4%,80.4%,77.4%,77.3%。多重比较和进化树分析结果显示,KDM4D基因在不同物种及生物进化中具有较高的保守性。蛋白结构域分析显示,克隆所得的KDM4D蛋白结构特殊,只具有1个JmjN (Jumonji N)和1个JmjC (jumonji C)结构域,与KDM4家族其他成员相比缺少PHD (plant homeodomain)和Tud (tudor)功能域。KDM4D蛋白质三级结构预测结果显示,水牛、黄牛和人3种物种间具有较高的相似性。转染结果显示,构建的重组质粒可以在HEK293T细胞中表达。本试验成功克隆水牛KDM4D基因,对其进行生物信息学分析,构建了真核表达载体pEGFP-C1-KDM4D,并在HEK293T细胞中成功表达。