滇龙胆草中香叶醇10-羟化酶基因的克隆、蛋白结构及表达分析

本研究基于滇龙胆草转录组数据分析,使用RT-PCR技术克隆获得两条香叶醇10-羟化酶基因,命名为GrG10H1和GrG10H2。使用在线软件对其进行了生物信息学分析,两条基因全长分别为1548 bp、1482 bp。系统进化分析显示该基因与细胞色素P450家族中CYP76B亚家族亲缘关系最近。通过对该蛋白进行三维结构预测、同源模建和分子对接,分析了GrG10H蛋白活性口袋中可能参与催化功能发挥的关键氨基酸残基。荧光定量PCR表明GrG10H1基因在叶中表达水平最高,茎次之,根最低。而GrG10H2基因在根和叶中表达水平较高,在茎中几乎不表达。本研究还建立了能够生产龙胆苦苷的愈伤组织细胞培养体系,为进一步解析龙胆苦苷生物合成机制奠定了基础。

管花肉苁蓉花中查耳酮合酶的基因克隆、功能鉴定与表达分析

目的 研究管花肉苁蓉Cistanche tubulosa花中查耳酮合酶(chalcone synthase)Ct CHS蛋白的功能和Ct CHS基因在白、红、紫3种颜色花中的表达模式。方法 利用RT-PCR克隆Ct CHS基因并进行生物信息学分析。将p ET-28a-CtCHS质粒转入大肠杆菌通过IPTG诱导蛋白表达。将Ct CHS重组蛋白与底物4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A孵育并利用HPLC和MS检测产物。将p CAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS质粒转入拟南芥原生质体观察CtCHS蛋白亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Ct CHS基因在3种颜色管花肉苁蓉花中的表达模式。结果 克隆出1条Ct CHS基因,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为1173 bp,编码390个氨基酸,蛋白相对分子质量为42 800,具有查耳酮合酶保守的催化残基Cys164、His303、Asn336。利用大肠杆菌外源表达Ct CHS蛋白并纯化获得重组蛋白。Ct CHS蛋白能够催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮。Ct CHS蛋白主要定位于细胞质。Ct CHS基因在紫、红色花中高表达,相对表达量分别为白色花中的8.44、3.21倍。结论从管花肉苁蓉花中克隆出1条Ct CHS基因并外源表达蛋白,CtCHS蛋白具有查耳酮合酶功能,Ct CHS基因在颜色更深的花中表达量更高,表明Ct CHS基因可能调控管花肉苁蓉花色,为进一步研究管花肉苁蓉花色调控机制奠定基础。

多酶催化级联反应在天然产物酶法合成中的应用研究进展

酶作为一种生物催化剂,具有催化效率高、反应选择性强、目标产物专一、反应条件温和、环境友好等优点,是合成复杂有机分子的重要工具。且随着基因测序技术、分子生物学、遗传操作等技术的不断发展,酶的多样性稳步增加,可催化的反应类型也逐步多元化。在酶催化合成过程中,大多数简单反应通过单酶催化即可完成,而很多复杂反应的发生往往需要2个或以上的酶参与催化。因此,将多个酶组合到一起,构建多酶催化级联反应已逐渐成为生物化学领域的一个研究热点。如今,越来越多结构复杂的天然产物的生物合成途径得到解析,具有新颖催化活性的次级代谢酶不断被鉴定、发现并组合应用于结构多样性天然/非天然小分子的酶法合成中。该文总结了一系列多酶催化级联反应的例子,着重介绍了级联催化方法在糖类、核苷类、黄酮类、萜类、生物碱类以及手性分子等化合物合成中的应用,并对多酶催化级联方法目前存在的问题、解决对策及未来发展方向进行了讨论与展望。

管花肉苁蓉花中二氢黄酮醇4-还原酶的克隆、表达分析和酶活性鉴定

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是花色素苷生物合成途径的关键酶,在植物花色调控中发挥重要作用。本研究通过管花肉苁蓉花转录组数据分析,利用RT-PCR技术克隆出一条DFR基因并命名为CtDFR,其开放阅读框(ORF)长1263 bp,编码420个氨基酸,蛋白分子质量为47.5 kDa。序列分析表明CtDFR具有NADPH结合域和底物特异性结合域。实时荧光定量PCR表明CtDFR在管花肉苁蓉的红、紫色花中高表达,相对表达量分别是白色花的4.04、19.37倍。构建原核表达载体pET-28a-CtDFR,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功表达CtDFR蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。体外酶活性分析表明,重组蛋白CtDFR能催化二氢山柰酚、二氢槲皮素、二氢杨梅素生成无色天竺葵素、无色矢车菊素、无色飞燕草素。亚细胞定位实验结果表明CtDFR主要定位于细胞质中。本研究结果表明CtDFR在管花肉苁蓉花色调控中起到重要作用,为进一步探讨管花肉苁蓉花色形成及调控机制研究奠定了基础。

蛇足石杉内生真菌的分离鉴定及其代谢产物乙酰胆碱酯酶抑制活性及抗炎活性研究

从蛇足石杉中分离鉴定出27株内生真菌,其中茎和叶中分布较多,根中分布较少;用r DNA-ITS序列分析技术对菌株进行了种属鉴定,其中1株属于担子菌门,其余26株菌分属于子囊菌门3纲5目6科9属26种,其中优势菌株为子囊菌门子囊菌纲小丛壳目小丛壳科刺盘孢属,占总菌株的48. 15%;分别采用Ellman’s法和Griess法对分离得到的内生真菌发酵粗提物的乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗炎活性进行筛选发现,4株内生真菌粗提物对乙酰胆碱酯酶具有一定的抑制作用,半数抑制浓度(IC50)为42. 5~62. 4 mg·L-1;部分内生真菌粗提物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264. 7 NO的产生具有抑制作用,IC50为2. 2~51. 3 mg·L-1,显示其具有潜在的抗炎活性;进一步通过LCMS-IT-TOF分析对其中一株内生真菌HS21的乙酸乙酯提取物进行了化学成分分析,共鉴定17个单体化合物,包括6个聚酮类、4个二苯醚类、7个杂萜类。

Triterpenoids from the roots of Rubus parvifolius

Two new oleanane-type triterpenoids, parvifolactone A(1) and rubuside P(2), together with 11 known triterpenoids, fupenzic acid(3), 18,19-seco,2α,3α-dihydroxyl-19-oxo-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid(4), euscaphic acid(5), maslinic acid(6), 1β-hydroxyeuscaphic acid(7), 2α,3α,19α,23-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid(8), 2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid(9), glucosyl pinfaensate(10), rubuside J(11), 2α,3α,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-24,28-dioic acid(12), and 2α,3β,19α- trihydroxyurs-12-en-23,28-dioic acid(13), were isolated from the roots of Rubus parvifolius.