转染及培养条件对外源性钙离子ATP酶SERCA1a表达的影响

目的评估不同转染及培养条件下COS1细胞过表达钙离子ATP酶SERCA1a的量及活性,探讨影响真核细胞目标蛋白质表达量及活性的因素。方法应用常规的全量或者半量DNA、lipofactamin和plus reagent转染COS1细胞,37℃、34℃或31℃培养2至5d。提取微粒体蛋白后定量并测定SERCA1a的ATP酶活性。结果微粒体蛋白量在细胞培养3至4d达到高峰,改变转染及细胞培养条件,未见明显变化;降低细胞培养温度及提高DNA转染用量,可增加SERCA1a表达量;SERCA1a表达量在8μg DNA转染细胞31℃培养3d达到最高,然而降低细胞培养温度后,SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量也随之下降;31℃表达的SERCA1a,其ATP酶活性降低比EP生成量减少的幅度更大,并且ATP酶活性及EP生成量随着细胞培养时间延长而增加。结论应用常规的半量转染试剂、全量DNA瞬时转染COS1细胞,37℃培养3-4d可获得最大量具有正常酶活性的SERCA1a蛋白。降低培养温度虽然可以提高外源性SERCA1a的表达,但却可能影响细胞内蛋白质的准确折叠及正常降解。