两个链霉菌复制子探针载体的构建

因链霉菌质粒的大小、拷贝数各异,并不是所有的质粒都易于分离和纯化,尤其是低考贝的大质粒,质粒的分离提取往往耗资费力。在这种情况下。

以链霉菌高拷贝质粒pIJ101上一个专一性DNA片段所介导的链霉菌质粒之间的共整合体的形成

在链霉菌高拷贝质粒pIJ101上发现并定位了一段0.6kb的DNA片段。这段DNA可专一性地刺激不同配对的质粒之间共整合体的形成以及在细胞中的累积。形成共整合体的2个质粒之间的亲缘关系可以相近,也可以很远。然而,这段刺激2个质粒分子之间共整合的DNA片段在2个质粒上必须处于互反取向,共整合体才能形成;而处于同一取向时,根本不能发生共整合。已经证明,这个片段的存在和方向极大地影响单链质粒DNA的积累。本文阐述了这个片段刺激质粒形成共整合体的可能机制。

链霉菌高拷贝质粒pIJ101的研究——Ⅴ.两个拷贝数突变子及其与克隆片段的关系

在分离和定位链霉菌高拷贝质粒 pIJ101上启动子活性区域的过程中,我们将 Bcll-E 片段经 MboI 进一步酶解后,克隆到由 pIJ101基本复制功能区所衍生的载体 pIJ425的 BgIII位点上,从转化变铅青链霉菌 TK64的原生质体所获得的硫链丝菌素抗性转化子中,发现了两个拷贝数极其异常的衍生质粒,命名为 pIJ2743和 pIJ2744。与 pIJ425相比,pIJ2743的拷贝数增加约10倍,而 pIJ2744的拷贝数则降低约10倍。拷贝数的剧增和剧减不是由于质粒宿主的突变,因为它们在重新转化的宿主中仍显示了突变型拷贝数特征。拷贝数的变化也不是由于载体的突变,因为切除插入片段后,载体区域再连接后的质粒仍与原始 pIJ425的拷贝数相同。将高拷贝突变子中0.63kb 的插入片段以两种不同的取向克隆到另一个类似于pIJ425的载体 pIJ486的 BamHI 位点,在一种取向插入时,新衍生的质粒仍显示出极高的拷贝数,而在另一种取向时,质粒的拷贝数不发生变化,说明拷贝数的剧增不仅只与插入片段有关,而且其功用具有明显的方向性,即为一顺式作用因子。