基于体外消化与发酵模型的多花黄精多糖对肠道菌群的影响

本研究采用模拟消化模型结合体外粪便菌群厌氧发酵模型,通过16S rDNA基因高通量测序分析肠道菌群结构,并通过GC-MS法测定短链脂肪酸含量的变化,从而探究多花黄精多糖(Polyonatum cyrtonema Hua.Polysaccharide,PCP)的益生元活性。结果显示:PCP经体外口腔、胃、小肠模拟消化,其未发生明显的变化。PCP经体外发酵能够迅速降低发酵液的pH。肠道菌群PCoA分析表明,PCP具有改变肠道菌群结构作用,且与菊粉具有一定类似性。在门水平上,相对于空白对照组PCP能显著(P<0.05)增加厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinomycetes)的相对丰度,显著(P<0.05)降低变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度;在属水平上,PCP能显著(P<0.05)增加有益菌双歧杆菌(Bifidobacterium)和巨单胞菌(Megamonas)等菌群相对丰度,显著(P<0.05)降低条件致病菌肠球菌属(Enterobacter)和志贺氏菌(Escherichia-Shigella)的相对丰度。同时,PCP促进短链脂肪酸的产生,其中,乙酸和丙酸含量显著(P<0.05)增加。本研究表明多花黄精多糖可能通过调节肠道菌群,促进短链脂肪酸产生。

灵芝孢子粉和孢子油脂溶性成分分析

分析不同破壁时间、不同来源灵芝(Ganoderma lucidum)孢子粉,灵芝孢子油加工原料(破壁孢子粉)、中间体(制粒后孢子粉、一级萃取孢子油、二级萃取孢子油)和孢子油成品,不同来源灵芝孢子油,不同植物油的脂溶性成分含量和指纹图谱。结果表明:破壁处理能显著增加灵芝孢子粉中脂溶性成分溶出;不同来源灵芝孢子粉中脂溶性成分含量有差异,但不同来源孢子粉指纹图谱相似度均大于0.90,有18个共有峰;灵芝孢子油加工原料(破壁孢子粉)、制粒后孢子粉、一级萃取孢子油、二级萃取孢子油及孢子油成品脂溶性成分指纹图谱有22个共有峰,不考虑孢子油成品中维生素E峰,孢子油加工原料、中间体和孢子油成品间指纹图谱的相似度均大于0.99;不同来源灵芝孢子油指纹图谱峰组成和峰面积有差异,指纹图谱相似度为0.490~0.925,有23个共有峰;植物油的色谱峰与孢子油相比存在较大差异。研究结果为灵芝孢子粉和孢子油的质量控制提供参考。

酶法提取灵芝孢子粉胞壁水溶性糖的工艺优化及分子量分布

为提高灵芝(Ganoderma lucidum)孢子粉胞壁水溶性糖的提取效率,以灵芝孢子粉胞壁残渣为研究对象,用单因素实验、响应面实验优化酶法胞壁水溶性糖提取工艺,并比较酶法和不同物理法处理的灵芝孢子粉胞壁水溶性糖的分子量分布。结果表明:最佳提取工艺为溶壁酶加量2%,酶解时间5 h,料液比1︰10(g︰m L)、温度40℃、pH6.5,在此条件下提取的灵芝孢子粉胞壁水溶性糖含量达到17.86%。分子量分布分析结果表明,酶解后的水溶性糖以低聚糖为主。研究结果可为有效利用和开发灵芝孢子粉提供参考。

沪农系列灵芝新品种活性成分及免疫活性对比研究

以相同条件下栽培获得的沪农系列7个不同品种的灵芝(Ganoderma lucidum)子实体作为研究材料,分析比较其总多糖、核苷、三萜和糖醇的含量、多糖重均分子量分布特征差异以及刺激RAW 264.7巨噬细胞释放NO的活性。结果表明:不同品种灵芝总多糖含量在1.15%~5.11%之间,含量较高的3个品种由高到低为‘沪农芝7号’(5.11%)、‘沪农芝8号’(2.36%)、‘沪农灵芝4号’(2.07%)。不同灵芝品种粗多糖分子量分布存在差异,‘沪农灵芝4号’主要含有重均分子量为3.38×10^(6)、4.24×10^(6)、4.38×10^(3)g·mol^(-1)的三个多糖组分,‘沪农灵芝1号’主要含有重均分子量为1.01×10^(7)和8.03×10^(3)g·mol^(-1)的两类多糖组分,‘沪农芝7号’主要含有重均分子量为4.50×10^(5)、6.20×10^(3)g·mol^(-1)的两个多糖组分,其余4个品种均含有重均分子量为(4.56×10^(3)~5.47×10^(3))g·mol^(-1)的多糖组分。7个灵芝新品种子实体中均含有胞苷、尿苷、鸟苷,其中‘沪农灵芝4号’的总核苷含量最高(1456.5μg·g^(-1));总三萜的含量为2241.93~5123.54μg·g^(-1),最高的为‘沪农灵芝1号’(5123.54μg·g^(-1));不同灵芝品种的糖醇含量存在一定差异,主要含有阿拉伯糖醇和甘露糖醇,赤藓糖醇含量较低,均低于0.9 mg·g^(-1)。七种灵芝子实体的粗多糖浓度在50~500μg·mL^(-1)范围内均能增强RAW 264.7巨噬细胞NO的释放量,其中‘沪农灵芝5号’的活性最强。研究结果将为沪农系列灵芝新品种的开发利用和推广应用提供参考。

定向采收‘沪农灵芝1号’高三萜和水溶性多糖原料研究

采用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)法和高效排阻色谱-多角度激光散射(HPSEC-MALLS)法检测灵芝(Ganoderma lucidum)‘沪农灵芝1号’不同生长期(接种后2~7个月,分别命名为P1~P6)子实体和菌基中三萜和水溶性多糖含量,并结合子实体和菌基的产量计算三萜和水溶性多糖的产量。结果表明:子实体中灵芝酸C2、G含量在P1、P2期较高,灵芝烯酸B和灵芝酸D、F、DM含量在P2期最高,灵芝酸B、A、S、T和总三萜含量在P1期最高;菌基中灵芝酸C2、A、D、DM和灵芝烯酸B含量在P1期最高,灵芝酸G含量在P 5期最高,灵芝酸B、S含量在P 6期最高,灵芝酸F含量在P 1、P 6期较高,灵芝酸T、总三萜含量在P 5、P 6期较高。子实体中灵芝酸C2、G、B、D、F、DM,灵芝烯酸B,总三萜产量在P2期最高;灵芝酸A产量在P3期最高;灵芝酸S、T产量在P1期最高。菌基中灵芝酸C2、G、B、A、D、F、DM,灵芝烯酸B产量在P1期最高;灵芝酸S、T产量在P2期最高;总三萜产量在P1、P2期较高。子实体和菌基中的水溶性多糖含量和产量均在P1期最高。研究结果将为‘沪农灵芝1号’子实体的定向采收提供科学数据和指导。

灵芝水溶性和碱溶性多糖的提取工艺优化

对灵芝多糖的微波辅助水提取、碱提取工艺进行探究。以多糖得率为指标,采用响应面分析法对灵芝多糖的微波辅助水提取和碱提取工艺进行优化。水提取的最佳工艺条件为:微波功率325 W,料液质量比1∶35、提取时间24 min;碱提取的最佳工艺条件:NaOH质量分数5.4%,料液质量比1∶35、提取温度40℃、提取时间75 min。利用优化后的工艺对沪农灵芝和龙芝2号的子实体进行多糖提取,水溶性多糖(GLP1)得率均大于1%,碱溶性多糖(GLP2)得率均大于5%。多糖的红外谱图显示:沪农灵芝的GLP1、GLP2和龙芝2号的GLP1、GLP2均有可能是氨基多糖;沪农灵芝的GLP2和龙芝2号的GLP2中存在吡喃糖环、甘露糖苷。优化后的工艺能显著提高灵芝水溶性、碱溶性多糖产量,不同灵芝材料中水溶性多糖、碱溶性多糖具有差异性。

补料方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

在50 L发酵罐中采用4种补料培养方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜进行比较。结果表明,通过补料可以明显地促进灵芝菌丝体的生长和灵芝三萜的合成,同时,不同的补料方式对菌丝体生长和灵芝三萜合成有不同的影响。采用指数补料方式可获得较高的菌丝体干质量,并提高灵芝三萜含量,与传统的发酵方式相比,采用此补料策略取得了较好的效果。发酵终点灵芝菌丝体干质量达到17.68 g/L,灵芝三萜含量达到4.58 g/100 g干菌丝体,分别比分批发酵提高了65.70%和100.88%。

白肉灵芝子实体和菌丝体活性成分的比较

对四川和西藏栽培的白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)子实体(编号分别为GLFS、GLFT)及液体发酵菌丝体(编号为GLM)中多糖、三萜、糖醇、核苷含量及多糖分子量分布特征进行比较。结果表明:GLFS和GLFT中多糖含量相对较低,分别为0.87%和0.79%,GLM多糖含量相对较高,为1.54%,子实体和菌丝体多糖的分子量分布有差异,子实体含有重均分子量为9X 10^(5)~2X 10^(6)的多糖组分;白肉灵芝子实体和菌丝体中均含有阿拉伯糖醇和甘露醇,其中GLFS的阿拉伯糖醇含量较高,为71.91μg.mg^(-1),菌丝体中还含有少量赤藓糖醇;GLFS和GLFT中核苷种类相同,但GLFS中尿苷、腺嘌呤、鸟苷含量显著高于GLFT的,菌丝体GLM中核苷种类少于子实体的,但其中胞苷、鸟苷、腺苷的含量显著高于子实体的;子实体中三萜种类丰富,检测出10种已知三萜,含量为25.9~116.1μg.g^(1),菌丝体中三萜种类较少,仅检测出灵芝酮三醇和灵芝醇A两种已知三萜,含量分别为217.5和121.3μg.g^(-1)。

基于通气量调控的灵芝菌丝体胞内多糖发酵工艺优化

采用5L搅拌式发酵罐进行灵芝(Ganoderma lucidum)液态深层发酵实验,考察通气量对灵芝菌丝体生长和胞内多糖合成的影响。结果表明:在保持其它因素不变的条件下,通气量9 L/min时菌丝体干重最高,达到15.42 g/L;通气量6 L/min时胞内多糖得率最高,为2.10 g/L。根据发酵过程中菌丝体生长的比生长速率、胞内多糖比合成速率,提出四阶段通气量控制策略:0～31.2 h通气量为6 L/min;31.2～43 h通气量为9 L/min;43～55 h通气量为6 L/min;55～96 h通气量为5 L/min。利用上述策略发酵得到的菌丝体干重为17.35 g/L,比9 L/min条件下提高了12.59%,胞内多糖得率为2.83 g/L,比6 L/min条件下提高了35.75%。研究结果可为规模化液态深层发酵生产灵芝胞内多糖提供参考。

灵芝β-葡聚糖磷酸化衍生物体外抑制肿瘤细胞增殖的作用

采用磷酸盐法对灵芝(Ganoderma lucidum)β-葡聚糖进行磷酸化修饰,在不同反应温度下(60、70、80、90、100℃)得到灵芝β-葡聚糖磷酸化衍生物(PGLP1~5),随着反应温度的上升,衍生物取代度(degree of substitution,DS)逐渐增大,重均分子量(average molecular weight,Mw)逐渐下降,反应温度为100℃时取代度最大为1.02。灵芝β-葡聚糖磷酸化衍生物体外对肿瘤细胞K562和L1210的增殖均有抑制作用,随着取代度增加,抑制率增高,且呈浓度依赖性;取代度最大的磷酸化衍生物PGLP5(DS=1.02,Mw=0.8×10^4)在200μg·mL^-1浓度下,对K562和L1210细胞增殖的抑制率分别为58.74%和50.05%,其IC50值分别为99.61μg·mL^-1和187.52μg·mL^-1。研究结果表明,灵芝β-葡聚糖磷酸化衍生物具有体外抗肿瘤活性,且抗肿瘤活性强弱与其取代度大小有关,取代度越大,抗肿瘤活性越强。

灵芝β-葡聚糖硫酸化衍生物抑制脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7产生NO的活性

采用氯磺酸法对灵芝(Ganoderma lucidum)β-葡聚糖进行硫酸化修饰,在不同反应温度下(40、50、60、70、80、90℃)得到灵芝β-葡聚糖硫酸化衍生物(SGLP1~SGLP6),随着反应温度的上升,硫酸化衍生物取代度逐渐增加,反应温度为60℃时取代度最大为1.72,之后随着反应温度上升,取代度逐渐下降;随着反应温度的增加衍生物的重均分子量逐渐下降。灵芝β-葡聚糖衍生物的溶解度为0.901~1.102g/100mL,与硫酸化前相比溶解度提高约50倍。灵芝β-葡聚糖硫酸化衍生物具有抗炎作用,对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO有一定程度的抑制作用,并呈浓度依赖性,且随着取代度增加,抑制率增高;对LPS刺激RAW264.7细胞的吞噬活性也具有显著的抑制作用,且随着取代度增加对细胞吞噬活性的抑制作用增加;取代度相近时,重均分子量较大的硫酸化衍生物对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO的抑制率较高以及对细胞吞噬活性的抑制作用也较强,说明硫酸化多糖的体外抗炎活性与其硫酸化衍生物的取代度和重均分子量相关。

面向规模化应用的竹荪多糖液态深层发酵工艺优化

利用规模化生产工艺提高竹荪菌丝体胞内多糖得率,通过对竹荪菌丝体液态深层发酵培养基组分的筛选,采用单因素试验与Box-Behnken响应面法确定竹荪菌丝体液态深层发酵的最佳培养基配方为:葡萄糖32.3 g/L,酵母粉4.5 g/L,磷酸二氢钾2.1 g/L,硫酸镁2.5 g/L。在此条件下竹荪胞内多糖得率的预测值为1.23 g/L,摇瓶实验验证胞内多糖得率为1.19 g/L,与预测值相当。在5、30 L和50 L发酵罐中验证胞内多糖得率分别达到1.43、1.28 g/L和1.26 g/L,分别高于预测值16.26%、4.06%和2.43%。本研究优化获得的竹荪菌丝体液态深层发酵工艺有效促进了竹荪胞内多糖的高产,该工艺可为竹荪多糖的规模化生产应用提供较好的参考。

刺芹侧耳下脚料水溶性细胞壁多糖碱提工艺优化及活性分析

采用碱提法提取刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)下脚料水溶性细胞壁多糖,以得率、多糖含量和β-葡聚糖含量为主要指标,对提取过程中的碱液浓度、料液比、提取温度和提取时间等因素进行考察,优化的提取工艺:1 mol/L的NaOH溶液为提取溶剂,料液比1∶20(g∶mL),提取温度30℃,提取时间4 h,在此条件下,所得水溶性细胞壁多糖组分得率6.25%,多糖含量74.56%,β-葡聚糖含量56.37%。高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测仪联用法(HPSEC-MALLS-RI)分析结果显示,该组分主要含4个峰,其中峰1和峰2对应的组分相对分子质量分别为1.36×10^7和2.68×10^6,峰3和峰4对应的组分相对分子质量分别为3.15×10^5和9.82×10^3;体外免疫活性检测结果显示,该水溶性细胞壁多糖组分具有刺激巨噬细胞释放NO和促进小鼠脾淋巴细胞增殖的活性。

蛹虫草中异源表达天蚕菌素抗菌肽

利用蛹虫草(Cordyceps militaris)自身强启动子,构建天蚕菌素抗菌肽过表达载体。借助农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的遗传转化系统,在蛹虫草中实现了表达。提取野生型菌株和转基因菌株的蛋白,比较其抑菌活性,实验结果表明,转化了抗菌肽的菌株中的蛋白抑菌活性高于野生型菌株。

灵芝孢子粉苦味与三萜含量的相关性

对不同来源的灵芝(Ganoderma lucidum)孢子粉原料及产品的苦味进行感官评定和三萜含量测定,分析苦味与三萜含量的关系。结果表明:不同灵芝孢子粉原料及产品中三萜的含量存在差异,大部分孢子粉混悬液无法尝到苦味,当孢子粉混悬液中三萜的质量浓度超过其苦味阈值30μg·mL^-1时,就可以品尝到苦味;灵芝孢子粉的苦味与其所含的三萜含量呈正相关性,三萜含量越高孢子粉的苦味越强,提取浓缩可以提高孢子粉产品中的三萜含量,使其呈现苦味。

广叶绣球菌子实体细胞壁多糖特征及其体外激活Dectin-1受体活性

广叶绣球菌(Sparassis latifolia)子实体水提残渣经超微粉碎、热水提取、20%~90%乙醇逐级沉淀获得8个细胞壁多糖组分(20E、30E、40E、50E、60E、70E、80E和90E),对其得率、多糖含量、β-葡聚糖含量、分子量分布特征、单糖组成、体外免疫活性进行测定。结果表明:广叶绣球菌水提残渣超微粉水提物得率为20.80%,其多糖含量为78.16%;水提物经乙醇逐级沉淀所得组分中,20E的得率最高,占提取物总量的27.16%,其多糖和β-葡聚糖含量分别为82.58%和35.54%;其余各组分得率和β-葡聚糖含量均较低,其中30E、40E、50E、60E这4个组分的多糖含量较高,均达到80%以上,而70E、80E、90E的多糖含量为26.36%~52.55%。利用高效凝胶尺寸排阻色谱多角度激光散射示差折光检测仪联用法(HPSEC-MALLS-RI)对20E、30E、40E、50E、60E的分析结果显示,20E主要含有2个峰,其重均分子量分别为1.47×10^7和5.06×10^6;30E、40E、50E和60E组分均主要含有1个均一对称峰,且随着醇沉浓度的增加,其重均分子量逐级减小。单糖组成分析结果显示:20E、30E、40E、50E、60E中的多糖均主要由葡萄糖组成,另外还含有少量半乳糖、岩藻糖和甘露糖,葡萄糖的摩尔百分比均超过80%。20E、30E、40E、50E、60E都具有体外激活Dectin-1受体的活性,其中20E的活性最高。

不同灵芝菌株子实体多糖的特征分析及免疫活性评价

采用高效分子排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测器联用法对不同灵芝菌株的110个(Ganoderma lucidum)子实体样品的多糖重均分子量分布进行分析,依据出峰时间和出峰数量,可将这些样品分为4组:A组有7个样品,其子实体多糖含3个组分GLP 1、GLP 2、GLP 3;B组有77个样品,其子实体多糖含1个组分GLP 3;C组有24个样品,其子实体多糖含2个组分GLP 1、GLP 3;D组有2个样品,其子实体多糖含2个组分GLP2和GLP3。GLP1、GLP2的重均分子量分别为1.85×10^(6)~5.47×10^(6)、2.16×10^(6)~5.73×10^(6) g·mol,GLP3的重均分子量约为10^(4) g·mol^(-1)。用乙醇分步沉淀法对8个代表性灵芝子实体的高分子量多糖组分(重均分子量>10^(6) g·mol^(-1))进行分离,得到纯度较高的GLP1(多糖含量80.47%~92.52%)和GLP2(多糖含量69.75%~91.71%),并对其重均分子量、单糖组成、糖苷键连接方式以及免疫活性进行比较,结果表明:GLP1和GLP2为结构不同的葡聚糖,其中GLP1是以β-(1→3)-连接为主链、以β-(1→6)-连接为支链的葡聚糖,而GLP2组分是以α-(1→4)-连接为主链、α-(1→6)-连接为支链的葡聚糖;GLP1组分与Dectin-1受体结合激活免疫的活性优于GLP 2组分。研究结果表明,针对灵芝免疫产品开发时,应更加关注灵芝子实体中高分子量多糖GLP1组分的分布和含量。

筛选高抗氧化能力的灵芝诱变菌株

利用DPPH(1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除实验,从经常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变获得的103个灵芝(Ganoderma lucidum)诱变菌株中初步筛选出14个抗氧化能力强的优良菌株,以DPPH自由基清除率、铁离子还原能力及ABTS自由基清除能力为指标对其抗氧化能力进行进一步评价,并分析了菌丝体水提物中多糖、多酚含量与抗氧化能力间的相关性。结果表明:诱变菌株A14、A19的DPPH自由基清除率、铁离子还原能力、ABTS自由基清除能力较出发菌株G0157均显著提高,显示出较强的抗氧化活性;菌丝体水提物的抗氧化活性与其多酚含量显著相关,表明多酚是灵芝菌丝体水提物发挥抗氧化作用的主要活性物质。

利用阶段pH控制提高灵芝深层发酵合成三萜能力的研究

采用3 L发酵罐考察不同pH发酵条件对灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体生长和灵芝胞内三萜合成的影响。结果表明,在pH4.5条件下,菌丝体干重和胞内三萜含量均最高,分别为12.31 g·L^-1和237.91 mg·L^-1。根据不同pH条件下,灵芝发酵过程中菌丝体的比生长速率、三萜比合成速率的变化,提出四阶段pH控制策略:0~26 h pH自然,26~36 h pH4.0,36~81 h pH4.5,81~168 h pH5.0,在此条件下,在3 L发酵罐中发酵,灵芝的菌丝体干重为14.18 g·L^-1,比对照(pH自然)和pH4.5时分别提高59.15%和15.19%,灵芝胞内三萜含量279.59 mg·L^-1,比对照和pH4.5时分别提高47.72%和17.52%;在50 L发酵罐中进行发酵验证,菌丝体干重和灵芝胞内三萜含量分别为13.54 g·L^-1和256.97 mg·L^-1。本研究的四阶段pH控制策略可较大幅度提高灵芝胞内三萜产量,且该发酵工艺操作简单易行,可为利用规模化深层发酵技术生产灵芝胞内三萜提供有益的参考。

粉碎细度对灵芝子实体水提物中多糖组成和体外免疫活性的影响

采用普通机械粉碎和超微粉碎法获得子实体碎块(1.0cm×0.5cm)和不同细度(10~200目)的灵芝(Ganoderma lucidum)子实体粉,对其提取物得率、多糖含量、相对分子质量分布特征、单糖组成及体外免疫活性等进行了系统比较分析。结果表明,实验范围内,随子实体粉细度增加,提取物的得率和多糖含量也提高,相对分子质量为2×10~6~3.5×10~6的多糖组分在提取物中所占比例增加。与子实体碎块相比,当粉体达到100目时,水提物总得率从6.41%提高到7.89%,增加了23.1%;而30%乙醇沉淀部分得率由原来的0.67%升高到2%以上,提高了2倍。单糖组成分析结果显示,30%乙醇沉淀的大分子多糖(30E)主要为葡聚糖,70%乙醇沉淀多糖(70E)主要含有半乳糖和葡萄糖,另外还含有少量的岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸,增加粉碎细度对70E部分的单糖组成没有显著影响。与70E部分相比,30E部分均表现出较好的刺激巨噬细胞释放NO的活性。