盐碱胁迫对尼罗罗非鱼鳃Na^+/HCO_3^-共转运子、碳酸酐酶基因表达的影响

为了探讨盐碱胁迫条件下鱼类渗透生理调节机制,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验材料,PCR扩增得到了Na^(+)/3HCO^(-)共转运子(NBCe1)基因c DNA部分序列,比较了单盐(盐度10、盐度15)、单碱(1.5 g/L、3 g/L Na HCO3)、盐碱混合(盐度10,碱度1.5 g/L;盐度15,碱度3 g/L)胁迫后不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h)血清渗透压、离子浓度(Na^(+)、K^(+)、Cl–、Ca2^(+))以及鳃碳酸酐酶(CA)活性、CA与NBCe1基因m RNA表达变化。结果显示,不同胁迫条件下,血清渗透压、离子浓度、鳃组织CA酶活、CA与NBCe1基因m RNA表达变化均与胁迫强度呈正相关。随时间推移,血清渗透压、离子浓度呈现先上升后下降的变化趋势,单盐、盐碱混合组血清渗透压值较单碱组高。单盐、单碱、盐碱混合组中,NBCe1基因m RNA在鳃中均呈略微上调,但不显著(P>0.05)。单碱组和盐碱混合组鳃CA活性较单盐组高,低盐碱胁迫(盐度10,碱度1.5 g/L)下CA活性较晚达最高值;不同胁迫条件下,CA基因m RNA表达均表现上调,单碱、盐碱混合组更为显著(P<0.05),推测CA较NBCe1对体内3HCO^(-)转运作用更为显著。研究结果为尼罗罗非鱼盐碱适应生理调节提供了基础资料。

盐碱胁迫对尼罗罗非鱼血清渗透压、离子浓度及离子转运酶基因表达的影响

为了解鱼类适应盐碱水环境的生理变化机理,将尼罗罗非鱼从淡水直接转入4个不同盐碱混合梯度组(A组:盐度10,碱度1 g/LNaHCO3;B组:盐度10,碱度2 g/LNaHCO3;C组:盐度15,碱度1 g/LNaHCO3;D组:盐度15,碱度2 g/LNaHCO3)中进行为期96 h的急性胁迫实验,分别检测胁迫后0、6、12、24、36、48、72和96 h时尼罗罗非鱼的血清渗透压、血清Na+、K+、Cl-浓度以及鳃中Na+-K+-ATP酶(NKA)和碳酸酐酶(CA)基因相对表达量的变化过程。结果显示,血清渗透压、离子浓度以及鳃中NKA基因和CA基因mRNA表达量变化程度均与其盐碱胁迫浓度间呈正相关,变化过程随着实验时间推移均呈现为先升、后降,最后趋于平稳。B、D组血清渗透压峰值出现在24 h,A、C组出现在36 h。血清Na+、K+、Cl-浓度均在24 h达到峰值。B、D组NKA基因mRNA表达峰值出现在24 h,A、C组出现在36 h;除A组外,其余各组CA基因mRNA表达峰值时间出现在24 h。研究表明,尼罗罗非鱼具有一定的盐碱适应能力,盐碱胁迫下NKA、CA是参与离子转运、渗透压调节的重要转运酶。

pH、盐度及K^+、Ca^(2+)和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

【目的】确定萨罗罗非鱼精子活力最高时各因子的最佳参数,进一步提高尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂的受精率。【方法】利用显微镜观察对比不同梯度pH、盐度、离子及葡萄糖溶液中萨罗罗非鱼精子的活力状况,考察指标包括精子快速运动时间、寿命及激活率。【结果】pH 7.5~8.0时,萨罗罗非鱼精子激活率最高,达90%;在pH 7.5的条件下,精子快速运动时间和寿命最长,为66.33±2.25和933.17±25.79 s。在25‰~32‰的盐度范围内,萨罗罗非鱼精子活力较强,其中以30‰的精子活力最高,快速运动时间和寿命分别为63.50±2.35和402.50±7.31 s,激活率达90%。随K+浓度的增加,萨罗罗非鱼精子的快速运动时间、寿命及激活率均呈先升高后降低的变化趋势,其中以75 mmol/L的精子活力最高,精子寿命为500.33±8.69 s,激活率为90%。Ca2+对萨罗罗非鱼精子活力有明显抑制作用,其浓度为37.8 mmol/L时精子快速运动时间和寿命最长,分别为38.50±2.43和117.50±3.21 s,精子激活率为80%;而后随Ca2+浓度的增加,精子开始出现聚集现象,活力明显下降,Ca2+浓度增至151.2 mmol/L时,精子已完全失活。相对于K+和Ca2+,葡萄糖可适当延长萨罗罗非鱼精子寿命,其浓度为150 mmol/L时,精子寿命最长,为281.00±5.90 s,激活率达90%。【结论】针对尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工繁殖中受精率低的问题,生产上除了选择优质尼罗罗非鱼卵细胞、优化孵化环境及人工繁殖技术外,还可通过适宜游动介质参数(pH 7.5~8.0、盐度30‰~32‰、75~100 mmol/L K+、37.8 mmol/L Ca2+、100~125mmol/L葡萄糖)激活萨罗罗非鱼精子活力,进而提高其杂交受精率。

尼罗罗非鱼卵巢发育过程中性类固醇激素与卵黄蛋白原含量变化及Vtg mRNA表达特征

通过组织切片、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法,研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)卵巢发育过程中性类固醇激素(雌二醇E2、孕酮P)、卵黄蛋白原(Vtg)含量及Vtg mRNA相对表达水平变化规律。结果表明,尼罗罗非鱼性腺指数(GSI)与卵巢成熟发育间呈同步性变化,Ⅴ期达到峰值。血清中E2含量自卵巢Ⅱ期开始显著升高,Ⅳ期达到峰值,Ⅴ期后显著下降;血清P含量自卵巢Ⅱ期开始不断升高,Ⅴ期达到峰值,Ⅵ期显著下降;E2、P分别在卵巢成熟发育前期与后期发挥作用。肝中Vtg含量先升、后降,Ⅳ期达峰值;血清、卵巢中Vtg含量均自Ⅱ期开始增加,Ⅴ期达峰值,Ⅵ期显著降低;不同组织中Vtg含量变化与卵巢成熟发育间存在密切关联。肝中Vtg mRNA表达水平在Ⅲ期达到峰值,Ⅳ期后持续下调;卵巢中Vtg mRNA表达水平相对较低,Ⅴ期达到峰值;初步推测肝、卵巢同是尼罗罗非鱼Vtg合成部位,肝是Vtg合成的主要器官,在卵黄积累阶段最为活跃,而卵巢Vtg合成水平相对较低。

3种鳜鱼消化道结构与胃中泌酸胃酶细胞分布比较

利用石蜡切片技术比较了鳜鱼、斑鳜和杂交鳜(斑鳜♀×鳜鱼♂)胃、幽门盲囊、肠道结构特征。3种鳜鱼胃壁均由黏膜层、黏膜下层、肌层组成,黏膜层内能看到固有层;其中,鳜鱼、杂交鳜胃黏膜层相对厚度0.30±0.09、0.30±0.11,斑鳜胃黏膜层相对厚度较薄,约0.21±0.13。肠道由黏膜层、黏膜下层和肌层组成,黏膜层表面含有绒毛,绒毛层含有杯状细胞;鳜鱼与杂交鳜褶皱数、杯状细胞密度间差异不显著(P>0.05),但显著大于斑鳜(P<0.05)。鳜鱼、斑鳜和杂交鳜幽门盲囊平均数目分别为(2.138±0.173)个/μm2、(0.793±0.132)个/μm2和(1.098±0.218)个/μm2。幽门盲囊结构与肠道相似,3种鳜鱼的褶皱数目差异不显著(P>0.05),但斑鳜杯状细胞密度显著小于鳜鱼和杂交鳜(P<0.05)。同时,利用原位杂交技术比较了3种鳜鱼胃中泌酸胃酶细胞的分布特征,3个胃蛋白酶原基因探针均出现紫色杂交信号,且均位于胃黏膜层。同种鱼中,不同基因探针杂交信号细胞密度差异不显著(P>0.05);不同种类间,相同基因探针杂交信号细胞密度大小顺序均为鳜鱼=杂交鳜>斑鳜,且相互间差异显著(P<0.05)。消化道结构与泌酸胃酶细胞分布差异为鳜鱼消化生理学比较研究提供了基础资料。

尼奥罗非鱼及其亲本中性别分化相关基因的表达模式比较

Dmrt1、Amh、Cyp19a1a、Foxl2是鱼类性别决定与分化相关的重要基因,为了研究罗非鱼种间杂交后代的性别形成机制,对尼奥罗非鱼Oreochromis niloticus(尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus♀×奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus♂)及其亲本中这4个性别分化相关基因的性别表达模式进行了比较分析。结果表明:Dmrt1、Amh基因在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼精巢中的表达量显著或极显著高于卵巢(P<0.05或P<0.01),而Cyp19a1a、Foxl2基因在卵巢中的表达量则显著高于精巢(P<0.05),4个基因在尼奥罗非鱼精巢、卵巢中的表达模式与其亲本基本一致;奥利亚罗非鱼精巢中Dmrt1基因表达高于尼罗罗非鱼,卵巢中Cyp19a1a、Foxl2基因表达也高于尼罗罗非鱼;尼奥罗非鱼精巢、卵巢中4个基因的表达水平均低于其亲本,特别是精巢中Cyp19a1a、Foxl2基因的表达水平极低。推测Cyp19a1a表达抑制可能是引起尼奥罗非鱼雄性率高的重要条件之一。

催产激素对雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素水平变化的影响

【目的】筛选对雌性尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)性腺发育影响最明显的催产激素组合及最佳剂量,为开展尼罗罗非鱼人工催产与繁殖提供参考依据。【方法】设计5组标准剂量的催产激素组合,分别为:1地欧酮(DOM)6 mg/kg+促黄体素释放激素A2(LRH-A2)10μg/kg;2DOM 6 mg/kg+促性腺激素释放激素类似物(Gn RH-A4)8μg/kg;3DOM 6 mg/kg+LRH-A210μg/kg+绒毛膜促性腺激素(HCG)2000 U/kg;4DOM 6 mg/kg+LRH-A210μg/kg+HCG 2000 U/kg+鲤鱼脑垂体(PG)6 mg/kg;5DOM 6 mg/kg+LRH-A210μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+Gn RH-A48μg/kg,并选择组合3进行1.0、1.5和2.0倍的激素剂量筛选试验,然后检测注射后0、24、36、48和72 h雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素[促性腺激素释放激素(Gn RH)、促性腺激素(GTH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)]的含量变化。【结果】雌性尼罗罗非鱼血清Gn RH、E2含量于注射后24 h达最大值,GTH、P含量则在注射后36 h达最大值;其中,组合3、4和5引起的类固醇激素含量升高变化最明显,显著高于组合1和2(P<0.05,下同),但组合3、4、5间差异不显著(P>0.05,下同)。1.5倍标准剂量组引起的血清类固醇激素含量变化最明显,显著高于1.0和2.0倍标准剂量组,而1.0与2.0倍标准剂量组间无显著差异。【结论】进行尼罗罗非鱼人工繁殖时,使用多种催产激素组合的效果优于单一催产激素,且催产剂量一般应高于常规鱼类。

碱度胁迫对尼罗罗非鱼鳃离子细胞形态以及鳃、肾和肠中HCO3^-转运因子的影响

采用扫描电镜观察了不同碱度(0、2、4 g/L Na HCO_3)胁迫对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鳃离子细胞形态变化的影响,并采用免疫组化技术观察了鳃、肾、肠中4个HCO_3^-转运因子碳酸酐酶(CAⅡ、CAⅣ)、碳酸氢钠协同转运载体(SLC4A4)、Cl^-/HCO_3^-离子交换体(SLC26A6)的阳性反应变化。扫描电镜结果表明,鳃离子细胞分布在鳃小片基部。根据其表面开孔形状和尺寸,可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4种亚型,各亚型离子细胞的开孔尺寸随碱度胁迫强度增高呈正比增大,Ⅲ型离子细胞开孔尺寸变化最明显(P<0.01);离子细胞总数目也随碱度升高而增加,Ⅲ型离子细胞数目上升最为显著(P<0.01)。免疫组化结果表明,在淡水、碱水组中,CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6在鳃小片基部和肾中均有阳性反应,且随着碱度升高,阳性反应增强,但在肠道中未观察到阳性反应。本研究结果初步表明,尼罗罗非鱼可通过鳃离子细胞形态和数量调节适应碱度变化,鳃和肾为主要应答调节器官。

3种鳜鱼生长与摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原基因表达相关分析

为了解不同种类鳜鱼生长差异的生理基础与机制,比较研究了鳜(Siniperca chuatsi)、斑鳜(Siniperca.scherzeri)和杂交鳜(斑鳜♀×鳜♂)幼鱼30 d内的生长速率与日摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原(PGA1、PGA2、PGC)基因相对表达量间的关系。结果表明,鳜、杂交鳜和斑鳜日增重率分别为(1.171±0.180)g/d、(1.019±0.104)g/d和(0.433±0.078)g/d,生长速率快慢次序是鳜>杂交鳜>斑鳜。鳜、杂交鳜和斑鳜平均日摄食量分别为(6.1±0.31)g/d、(5.26±0.33)g/d、(4.24±0.23)g/d。胃蛋白酶比活力最高部位是胃,实验前期,3种鳜鱼胃蛋白酶比活力差异不显著;后期,鳜、杂交鳜和斑鳜胃蛋白酶比活力分别为(347.8±13.3)U/g、(303.4±12.1)U/g和(272.1±10.9)U/g。胃蛋白酶原基因表达量随生长阶段缓慢增加,PGC∶PGA1∶PGA2基因相对表达量比例是1.1∶1.0∶0.7;鳜胃蛋白酶原基因的相对表达量均为最高,杂交鳜相对表达量略高于斑鳜(P<0.05)。结果表明,3种鳜鱼的生长速率快慢与它们的摄食量大小之间呈正相关,摄食量大小与其消化能力间也具有相对应的关系。

鳜骨骼肌快肌和慢肌的组成特征比较

骨骼肌组成特征是鱼类肉质性状评价的重要基础。为全面了解鳜(Siniperca chuatsi)肉质性状的组成特征,通过制作骨骼肌石蜡切片,比较了鳜快肌和慢肌两种类型骨骼肌的组织学特征,快肌和慢肌在肌纤维细胞直径、形态上存在差异。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了鳜快肌和慢肌的蛋白质组成特征,它们在50～60 ku和10～15 ku大小的条带中存在差异。克隆了鳜快肌和慢肌肌球蛋白重链(MHC)S1结构域的序列,快肌和慢肌S1结构域cDNA序列长度分别为2 523 bp、2 520 bp,编码841、840个氨基酸,氨基酸序列的相似度为87.6%,以两个loop区的差异最大。研究结果表明,鳜快肌、慢肌在肌纤维细胞形态、蛋白质组成以及肌球蛋白重链分子结构上均存在较明显的差异,这些差异与其担负不同的运动功能相关。